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(無題) 削除/引用 No.7748-10 - 2019/03/11 (月) 07:58:21 - おお アミコンを使うなら、ポアサイズの大きさでものが落ちない程度のところでそれより低分子をカットしてしまうとか言うのもありかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.7748-9 - 2019/03/09 (土) 13:10:34 - moz 本筋では無いけど、これくらい濃縮するとexosomeもかなり混入してくるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7748-8 - 2019/03/09 (土) 11:41:17 - おお ゲルのサイズ、厚さにもよりますので、Minigelじゃなく一回り大きいものでコームの幅がある程度あれば５００ｕgは可能かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7748-7 - 2019/03/09 (土) 11:38:04 - おお 蛋白１gに対して１．４とか１．７グラムのSDSが必要と言われているのでかなり無理がある量だと思います。またタンパク量が濃すぎるとSDSが不足しているのも手伝って蛋白が熱変性で凝縮してしまうこともよくあります。 また、濃縮されるののが蛋白だけとは限らないので泳動を乱すようなものが多く混入してくるようでしたらうまく流れなくなっていくでしょう。この辺は経験のある人からのコメントがあったほうがいいかと思いますけど。 ただ結果往来ではあるので絶対ダメだとは言えませんので、濃縮後一度タンパク量を測って考えてみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7748-6 - 2019/03/09 (土) 11:34:48 - amicon ぺんぺんさん、ありがとうございます。 膜分画を取る目的で500ugアプライされたことがあるとのこと、それはやはりendogenousのものを取るために行われたのでしょうか？それとも、強制発現系からIPしてといったような作業が加わったものでしょうか？というのは、IPであれば目的のプロテイン（と思われる）バンドが特に強く見えるから泳動像が少々乱れても目的は達成されると思うのですが、endogenousのものをとる場合は、像が乱れると他のタンパクのバンドと混ざってしまって難しくなるかな？と思ったのです。 私の目的はクマーシーで染めて、標的バンドを切り出してアミノ酸シークエンスにかけることです。標的タンパクをIP出来る抗体が（少なくともコマーシャルのものでは）存在しない（データシートを無視して色々な抗体でIPを試したこともあるけど駄目でした）というのもあって、濃縮したものを流そうと思っているのですが、色々な、それぞれの濃度が不明なタンパクの混在した状態なので、切り出せない位に像が乱れるかなあ？などと想像します。まあ、やってみないとしょうがないですね、これは。 momさん、ありがとうございます。 ググッたら、 http://kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2823 が出て来ました。普通に考えれば100ug程度が最大量、と考えていいですかね？ https://www.researchgate.net/post/Amount_of_sample_load_on_gel_during_Western_Blot では、Tris-Acetate gelで100ug以上を流したら急に像が乱れたという報告をしてくれている方がいました。 とりあえず、100ugで流して目的バンドがクマーシーで見れないか試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.7748-5 - 2019/03/09 (土) 10:25:18 - mom SDSがタンパクに対して足りない。いろいろなタンパクが混ざっているならmax 10ug/laneほどでしょう。5ug程度なら再現性よく綺麗に流れると思う。 「SDS-PAGE ロード量]」でググれば www.thermofisher.com/jp/en/home/life-science/protein-biology/protein-gel-electrophoresis/protein-gels/recommended-well-loading-volumes-sample-loads.html

(無題) 削除/引用 No.7748-4 - 2019/03/09 (土) 10:23:59 - ぺんぺん まぁ指南書には500マイクログラムは載せ過ぎとの理解でしょうが、私はそれくらいアプライしたことがあります。膜分画を取って来た時ですね。 本番の前に一度、BSAを流してみたらいかがかな？ 1mg、0.5mg、、、、というように。

(無題) 削除/引用 No.7748-3 - 2019/03/09 (土) 09:43:26 - amicon ぺんぺんさん、返信ありがとうございます。 以前、2mLのメディアをAcetone Precipitationで濃縮したものをlysis Bufferに溶かしたサンプルでBSAアッセイにかけたことがあるのですが、濃度がだいたい2ug/ul、lysis Bufferの全量が70ulだったので、トータル140ugが2mLに入っている、つまりは70ug/ｍL程度が私のコンディションメディアの濃度だと予想しております。 8mLだと70 x 8でトータル560ug、これを1レーンは無理があるでしょうか？ 普段のウェスタンでは10ug/laneで流しているのですが、最大で何ugを流せるか知らないのです。使っているのはNuPAGEのBis-Tris gelなのですが、マニュアルには最大1バンド0.5ugとあるだけで、トータルのプロテインはどれだけ流せるかの記述は無いんですよね。

(無題) 削除/引用 No.7748-2 - 2019/03/09 (土) 09:08:20 - ぺんぺん 無血清だと言ってもオーバーロードの可能性は大きいと思います。 まずはタンパク質定量されてはいかがかな？

Amiconを使っての濃縮、その後にゲルに流すことについて 削除/引用 No.7748-1 - 2019/03/09 (土) 08:57:02 - amicon 細胞培養のコンディションメディアを対象に実験しております。細胞は293細胞で、メディウムはDMEMを使っています。 今、8mLのコンディションメディアを濃縮後にゲルに流してクマーシーで染めようとしているのですが、Amicon-Ultra4を二本使い、（4ｍLを75ul程度まで濃縮）x2で8mLを150ul程度まで濃縮し、その後にこの150ulをAmicon-Ultra0.5にかけて20ul程度まで濃縮して、8mL全てを1レーンに流そうと思っています。 このような形での濃縮、Amiconの2段使い、は問題があるでしょうか？また、このようにして濃縮したものをゲルの一レーンに流すのは無理があるでしょうか？マニュアルを読んだ限りでは、無血清のDMEMを使う限りにおいては特に問題になるようなことは無いと思うのですが、経験のある方がおられたらお話を聞いてみたいと思ってトピを立てさせていただきました。よろしくお願いします。

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