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(無題) 削除/引用 No.2823-14 - 2010/07/05 (月) 12:27:33 - ちゃい >あんまり低分子タンパクの泳動はやってませんが、20時間もかけているんですか？電流など適切なら構わないですが、いつも通りでいいのでは？60Vの感覚は分かりません。 泳動時間に関して心配していただいているようですが、これはTris-tricineのラージゲルで、電流・電圧はゲルのマニュアルに沿って行っており、100Vのコンスタントでも12時間から16時間かかるとなっています。20時間後にラボに戻る予定だったので、低めの６０Vに設定しました。 泳動の終了はInvitrogenのプレステインドのサイズマーカーを目安にしており、泳動フロントも十分ゲル下端より上方でしたので、抜けてしまったということはないと思います。 ＞スマイリングは分離ができていないので目的のバンドより直下に大量のタンパクがあったためでしょう。分離できれば解決すると思います。 それが、少量のタンパク（免疫沈降後）をロードしたSDS-PAGEでも逆スマイリングが起こりました。ただ、これまでのところLaemmliのバッファー・システム（Tris-glycine)でのみ起こっており、Bis-Tris-MES　のシステムでは経験していません。 やはりSDSの問題なんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2823-13 - 2010/07/05 (月) 11:28:45 - ばいや >[Re:9] ちゃいさんは書きました : > また、Tricineゲルでは泳動時間が20時間くらいかかるので、60Vでオーバーンバイトにしたのですが、低温室で流すべきだったんでしょうか？ あんまり低分子タンパクの泳動はやってませんが、20時間もかけているんですか？電流など適切なら構わないですが、いつも通りでいいのでは？60Vの感覚は分かりません。 流しすぎて抜けてしまったのでは？早めに止めて確認して、もう少し泳動時間の検討をした方がいいかもしれません。 私はいつも通りのアンペアで時間は早めにしてます。 あと、スマイリングは分離ができていないので目的のバンドより直下に大量のタンパクがあったためでしょう。分離できれば解決すると思います。

(無題) 削除/引用 No.2823-12 - 2010/07/05 (月) 10:23:21 - ちゃい >SDSを、古いやつとか精製度95%を使ってゲルを作ると逆スマイルand分離が悪くなる経験をしています。 新しく自作したバッファーにずいぶん前に作った10% SDSストックを使ったように思います。こういうところでも足をすくわれるんですね。 作り直します。

(無題) 削除/引用 No.2823-11 - 2010/07/05 (月) 10:07:52 - さく SDSを、古いやつとか精製度95%を使ってゲルを作ると逆スマイルand分離が悪くなる経験をしています。同じサンプルでも、新品99%SDSだと全然問題なく流れます。

(無題) 削除/引用 No.2823-10 - 2010/07/04 (日) 18:05:16 - qq ＞SDSを含まない転写バッファーですよね？ ＞（ゲルに含まれる過度なSDSが蛋白に作用し、メンブレンを通過させる 今回の場合、フロントの濃いSDSを抜くことだけを目的に考えると、むしろ0.1% SDSの入っているSDS-PAGEの泳動緩衝液を使用する方がよいかもしれないと考えています。 無責任なようですが、やってみないと判りませんね。 私の場合、BN-PAGEで転写するとき、6M urea/0.1%SDS/Tris-Glyで15min x 2 平衡化します。

(無題) 削除/引用 No.2823-9 - 2010/07/03 (土) 23:22:40 - ちゃい ＞手引き書によると、Tris-glycine, 15% PA Gelの分画範囲は10-43 kDa ＞分画範囲をはずれているものは長距離泳動してもほとんど改善しないと思います。Tris-Tricine系を試してみては。 仰るとおり、15%　Tris-glycine gelでは、泳動距離を長くしても6kDaと4kDaの距離はほとんど変わりません。ある程度は離れるのですが、ゲル下端2cmくらいは逆に分離が悪くなり、目的タンパクの0.2Daのサイズの違いを見たいのですが、満足のいくウエスタンができていません。 Tri-Tricine gelを試したのですが、電気泳動後はTGゲルと同じプロトコールで進めたところ、10ngのポジティブコントロールが検出できず、このシステムでは感度が悪いのかと思って諦めていました。泳動時間が20時間になるのが問題の原因かと思っていました。今考えると、ゲル厚が1.5mmであることも影響して、転写がうまく行っていなかったのではないかと思います。タンパクが小さく通常のメンブレンを使っているので、転写が強すぎると抜けるのではないかと思い、消極的になっています。ちなみにセミドライタイプで２０V 20分は問題でしょうか？ また、Tricineゲルでは泳動時間が20時間くらいかかるので、60Vでオーバーンバイトにしたのですが、低温室で流すべきだったんでしょうか？ タンパクを失うのを恐れて、転写前にゲルを洗うのもためらわれたのですが、SDSの影響を除くために、SDS抜きのメタノール20%の転写バッファーでゲルを10分から15分洗ってみます。 分画に分ける方法は、今試している所です。今まではRIPAで膜を含めて可溶化していましたが、今回は界面活性剤抜きのバッファーでホモジナイズし、上清を保存、そのペレットをRIPAで溶かしたものの上清、この2種類に分けてみました。初めて行っているので、まずはミニゲルで試してみます。 ポアサイズの小さいメンブレンを買ったほうがいいのでしょうか。自分のウエスタンのためだけに1ロール買うのがためらわれて買っていませんでした。実際のところ、4kDaのマーカーもうまく転写されています（転写後のゲルに残らずメンブレンに移っています）。

(無題) 削除/引用 No.2823-8 - 2010/07/03 (土) 21:55:05 - MTT 私はいつも大体25-40μg/ 1laneで流しています。スマイリングを防ぐには両端にSDS bufferを等量流してみるときれいに流れます。

(無題) 削除/引用 No.2823-7 - 2010/07/03 (土) 21:12:28 - kodama qqさま >３）泳動後、ゲルを取り出し、適量のSDS-PAGE泳動バッファーで揺すり洗いする（室温15min程度ならおそらく大丈夫？）。 SDSを含まない転写バッファーですよね？ （ゲルに含まれる過度なSDSが蛋白に作用し、メンブレンを通過させる原因になるから。ミリポア社のカタログで洗浄時間と吸着の関係が紹介されています。） 私はトリス・グリシン・メタノールを含むバッファーで１５分洗っています。

(無題) 削除/引用 No.2823-6 - 2010/07/03 (土) 17:10:24 - と考えている。 組織蛋白質抽出液の場合、ローディング蛋白質量はミニゲルの場合では10μg／lane、ラージゲルだと50μg/laneくらいを基準にして必要に応じてそのx0.5~x1.5量くらいの幅でやってる。この条件のとき、クマシー染色でみる分離パタンやWesternはデータとりあえずきれい。 組織重量あたりの蛋白質of interestが少ないのでいっぱいのせないと見えないならば、分画するといい。オーソドックスな細胞分画でもいいし、単にとりあえず核と核以外にわけてもいいし、界面活性剤有無で分画してもいいし、とにかくいらない蛋白質をへらして、いる蛋白質の相対量を増やす工夫をするだけでもだいぶ改善されるはず。ただはじめはどこに行くかわかんないから全部の画分をちゃんとチェックするのが大事。10KDa以下を分離したいなら〜17%ゲルかあるいはトリストリシンゲルになる。（トリストリシンは普通のSDS-PAGEとはバッファー系が違いややこしいので注意。）この分子量だと普通の転写膜だとトラップはかなり難しいかもしれない。BIO-RADとかでポアサイズの小さい、ペプチドシーケンス用のPVDF転写膜があったはず。興味あればカタログチェックして。これだと通常の転写条件で分子量数千のペプチド断片とかもいける。もちろんすごい小さいのは無理だけど。ただwesternすると多少バックが高かった気する。元々westernが第一目的でないからしょうがないけど。

(無題) 削除/引用 No.2823-5 - 2010/07/03 (土) 15:34:07 - AP 手引き書によると、Tris-glycine, 15% PA Gelの分画範囲は10-43 kDaとなっています。10 kDa以下は分解能が落ち、そのサイズに分布するタンパク質はすべてフロントラインとほぼ同じ位置に来ると思います。多少は分離できたとしても、きれいにバンディングしないのは当然といえるかも。高分子側でバンド間隔が狭くなるのと違って、分画範囲をはずれているものは長距離泳動してもほとんど改善しないと思います。Tris-Tricine系を試してみては。 1レーンにどれくらい載るかは、みなさんがおおよその数字はだしてくれました。ただ、同じ100 ugでも高分子から低分子までいろいろなタンパク質が混じったサンプルと、特定のタンパク質が高発現していて多くの部分を占めている場合とでは違うでしょう。1バンドが1 ugだともうかなり多くて、それより低分子側、高分子側の泳動像も影響を受けておかしくなるかんじです。

(無題) 削除/引用 No.2823-4 - 2010/07/03 (土) 12:44:25 - ちゃい ＞現時点でなにか問題が起きているのでしょうか？ 泳動のフロントが逆スマイルになることが続いております。ちなみにゲルはTris-glycine　15%です。逆スマイルになる原因として、バッファーの電荷が不足する、サンプルバッファーが良く混ざっていなかった、などが考えれると思い、バッファーもサンプルバッファーも作り直してみましたが、変わりませんでした。 14cmのラージゲルでは、ウェルが大きいため、タンパクを0.5mgくらいロードしているのですが、これが悪いのでしょうか。タンパクをロードしているレーンの隣をブランクとして、1xのサンプルバッファーのみを流すと、ゲル下端に近づくにつれて、タンパクがレーンをはみだして、つまり末広がりに流れます。 qqさんの仰るように、目的タンパクは泳動フロントにかなり近接しています。6kDaのマーカー付近に目的のバンドがあるのですが、泳動フロントと4kDaのマーカーが重なっていました。今回はラージゲルを使用し、レーンあたり、１ｘサンプルバッファー　100ulをロードしたため、SDS量が多すぎて、思い起こせばいつも見られていた大きなノンスペが消えていたのは、これが原因だったのかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2823-3 - 2010/07/03 (土) 11:06:53 - qq ＞組織中のタンパク（１０キロダルトン以下）をウエスタンで検出したいのです SDS-PAGEの泳動フロントには、フリーのSDSが大量に泳動されています。泳動フロントにSDSと一緒に泳動されているタンパク質は、（おそらく）転写されずに素通りしてしまいます。検出したいバンドは、フロントよりも十分に離れているでしょうか？フロント近くのタンパクは、転写されにくいかなあと想像します。 フロントのSDSをある程度ダイエットするためには、こんな方法があるかもしれません。 １）サンプルバッファーのSDSを2%であれば1%に落としてみる。 ２）サンプル量を少なくする。 ３）泳動後、ゲルを取り出し、適量のSDS-PAGE泳動バッファーで揺すり洗いする（室温15min程度ならおそらく大丈夫？）。

(無題) 削除/引用 No.2823-2 - 2010/07/03 (土) 10:22:48 - kodama 私は40ug/レーンで行っております。 過剰すぎるとバンドが乱れます。100ug/レーン以上は無理だと思います。 またノンスペも多くなります。 >組織重量あたりの目的のタンパク量が少なく、かなり多い量をロードしていたのですが、これがかえって分離を悪くしているのかと心配になってきました。 現時点でなにか問題が起きているのでしょうか？ 10KDa以下は転写時にメンブレンをすり抜ける場合があります。 ミリポア社から低分子向けのメンブレンも販売されていますので参考にしてみてください。（ただし条件をよく検討しないとノンスペが増えるそうです）

ゲルへのタンパクのローディング量について 削除/引用 No.2823-1 - 2010/07/03 (土) 10:07:41 - ちゃい いつも勉強させていただいています。 初歩的な質問で恐縮ですが、SDSーPAGE（その後ウエスタン・ブロッティング）で分離可能なレーンあたりのタンパク量はどれくらいでしょうか。教科書では10ugから100ugが限界のようですが、それが正しいのでしょうか。 ミニゲルとラージゲルとで違いはあるのでしょうか。 組織中のタンパク（１０キロダルトン以下）をウエスタンで検出したいのですが、組織重量あたりの目的のタンパク量が少なく、かなり多い量をロードしていたのですが、これがかえって分離を悪くしているのかと心配になってきました。 参考にさせていただきたいので、ご回答をお願いします。

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