私はいまPcDNA3(約5.3kb)のベクターにインサート(約2.6kbと2.8kb)をそれぞれライゲーションし、DH5αにトランスフォーメーションしています。
ネガコンとしてライゲーション反応時に、インサートの代わりにDDWを加えたものを用意しているのですが、インサートを加えたものとコロニー数に差が出ません。
自分の予想では、ネガコンはベクターが直鎖状のままなので、
インサートとライゲーションしたものに比べてトランスフォーメーションの効率が下がり、コロニー数が少なくなると思っていたのですがそうなりませんでした。
一度だけネガコンとの差を気にせずにプラスミドを精製し電気泳動したときは、ベクターのみやライゲーション後のバンドは現れず、2kb前後のバンドが得られるという現象が起こりました。
ちなみにベクターは「HindVとXbaT」のセットと「EcoRTとXhoT」のセットで切ってきます。以前の書き込みをみて制限酵素処理をO/Nでやりましたがコロニー数に差はありませんでした。一応このあと精製してインサートチェックをやってみようと思っているのですが…。
ライゲーション時のベクター：インサート比も１：１、２、３、10などいくつか試してみましたがうまくいきませんでした。
コロニーは生えているので原因はおそらくライゲーション反応がうまくいっていないのだと思いますが、対策が見当たらなくて困っています。
どなたかアドバイスをお願いします。 |
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