BioTechnicalフォーラム [ライゲーションがうまくいきません]

(無題)

No.2669-25 - 2009/01/20 (火) 21:01:47 - AP

>一度だけネガコンとの差を気にせずにプラスミドを精製し電気泳動したときは、ベクターのみやライゲーション後のバンドは現れず、2kb前後のバンドが得られるという現象が起こりました。

2 kb前後というと、5.4 kbの空のベクターのcccに相当しますが、それではないでしょうか。制限酵素で消化して泳動したのでしょうか。
もし制限酵素消化していたとしても、末端が削れて再環状化したとすると（ダブルダイジェストのベクターが再環状化したなら可能性有り）、もとの制限酵素では切れなくなっているのかもしれません。

(無題)

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No.2669-24 - 2009/01/19 (月) 22:15:27 - AP

意外とスレが伸びて、全体を読むのが大変になってきていますが、
読み返してみると、insert調製の問題の他に、vector調製にも問題がありそうです。

>ネガコンとしてライゲーション反応時に、インサートの代わりにDDWを加えたものを用意しているのですが、インサートを加えたものとコロニー数に差が出ません。
>10^5コロニー/ngのDH5αで、10ngのDNAを持っていき、リニアになることで2けた効率が悪くなると考えて10^4コロニーできるのが理論的ですが、効率が悪いことでさらにひとけた落ちていると考えました。
>1000コロニーだと多いのでしょうか？

多すぎると思います。その条件なら理想的にはzeroか、少なくともintactのプラスミドの時より4桁以上低くあるべきです。

形質転換効率はintactなプラスミドで算出するので、ベクターとインサートのligationがうまくいったとしても、それより1,2桁あるいはそれ以上、低くなってもおかしくありません。10^5 cfu/ug intact plasimidのコンピーテントセルでも、ligation産物で形質転換したら、10^2 cfu/ug vectorくらいの形質転換効率だったということも普通にありえます。

なのにネガティブコントロールでそんなにバックグラウンドがでるようでは、系が実用的なレベルでうまくいっていないと考えざるを得ないし、部分的にうまくいっていたとしても、当たりを見つけ出すのにいらぬ労力がかかります。

環状化していないプラスミドは形質転換してもコロニーは出てこないと考えて良いです。完全消化したベクターで再環状化を防ぐ工夫がされている場合、insertなしでligationしても、形質転換効率はzeroかそれに限りなく近くあるべきです。

・二重消化のベクターなら、ゲルろ過か、電気泳動で精製してMCSの小断片を除き、これが再びベクターに組み込まれるのを防ぐ。
・じゃなければ、脱リン酸化する。

さらに、意外と見逃されているのが、ベクターの切れのこりです。cccは精製の原理上、アルカリで部分変性して制限酵素で切れなくなっているフラクションが多少なりとも存在します。少量サンプリングして泳動しても見えないレベルでも、例えば 10 ngベクターのなかにそういうのが10 pg混じっているだけでも、10^5コロニー/ngのホストなら軽く1000コロニーでます。これを防ぐにはベクターも電気泳動で精製するしかないです。

(無題)

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No.2669-23 - 2009/01/19 (月) 14:00:55 - おお

>[Re:20] APさんは書きました :
> >確かにニックが入っているのかもしれませんね。
> >そうなるとプラスミドの精製からやり直したほうがよいですよね。
>
> 実は、ニックは菌内で容易に修復されるので、形質転換にはほとんど影響なかったりします。

実は基本的にこの意見にあグリーなんですよ。
でもあえて書いているというのがあります。

ニックが入っているという状態で、どれほどひどく
入っているかという点で見過ごす可能性がある
かもと思ってもいるわけです。初心者の方なら
まずは、しっかりした状態で感触をつかんでもらいたいですし、
電気えいどうで若干スメアを引いていて分解
が進んでいるかもしれない状態を、
なんかえいどうの調子がやるかったとか言って
気にしないでいる状態もあるかもしれないとも
思いますし。

プラスミドを精製し直すと言うのは悪くない選択
と思っている理由がもうひとつあります。

実はこの手のテクニックに精通しているひとに
弟子がついて、丁寧に次に何と教えながら
プラスミドにインサートを入れさせていた
のですが、どうしても入らないわけです。
最初は腕がわるいというか、変なことを
しているのではと疑って
1ステップずつ確認を進めていったのですが
どうしても原因が分からず、結局オリジナル
のチューブからトランスフォーメーションし
直し、精製してつかったら、同じ操作で
なんなくインサートが得られたという
のを見たことがあります。
たまたまマルチクローニングサイトが
変になったやつ(そんなことめったに
起こらないはずですが、、PCRより遥かに精度が良いはずなので)
ひろったかなぁ、、、という話をしたことが
あります。

そういう訳であえて精製し直しをこの手のとピで
指摘しています。

(無題)

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No.2669-22 - 2009/01/19 (月) 13:35:53 - おお

>[Re:19] 石川さんは書きました :

> 私もベクター用のプラスミドを制限酵素処理したあとに、
> エタ沈フェノクロ→CIAP処理→エタ沈フェノクロ→ゲル抽
> というステップを踏んでいます。
CIAP処理をしているのであれば、ゲルからの抽出を省けると思います。
ただし、プラスミドが完全に直さに切れてないといけません。

逆にCIAP(脱燐酸か)をはぶいて、ゲルで抽出というてもあります。
この場合はプラスミドの末端同士がコンパチブルでないことが
前提です。
脱燐酸かはたいていクローニングではさほど問題のない操作ですが
トランスフォーメーションの効率を下げているのは確かです。

>
> 私の理解が足りないのだとは思いますが、
> CIAP処理してもゲル抽によって短いフラグメントを取り除かないと、インサートと短いフラグメントがライゲーションする可能性はないのでしょうか？

プラスミド、マルチクローニングサイトのフラグメント両方が脱燐酸か
されていますのでライゲーションが起こらないはずです。ですから
共存していても理論上問題はありません。実際に問題にならないです。

>
> またコロニー数ですが、申し訳ないことに効率を間違えてました。
> 10^5コロニー/ngのDH5αで、10ngのDNAを持っていき、リニアになることで2けた効率が悪くなると考えて10^4コロニーできるのが理論的ですが、効率が悪いことでさらにひとけた落ちていると考えました。
> 1000コロニーだと多いのでしょうか？

http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0290.asp
CIAP(脱燐酸か)が効いていたらまず殆どはえないようです。
直さプラスミドで両端がお互いコンパチブル出ない場合も
可也ひくいと思います。

それでも多く生えてくる時は先ずは制限酵素の切れ残りとか
CIAPが不完全とか、そういうののコンビネーションを
疑うのですが、そういう時はからのベクターばかり取れて
インサートが入ったものが取れないという状況
に陥るとおもいます。

たしか、全く関係ないサイズに現れるプラスミドが
取れてきたわけですよね、、、、

ですから、何かちがうプラスミドが電気えいどうとかで
コンタミしているとかいろいろ疑ったりしているわけです。

こうせい物質が弱ってバックグランドが出てるとか、
コンピ自身に耐性菌がコンタミしているとか、、、
DNA量の測り方がおかしいということはないと思いますが、、、

(無題)

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No.2669-20 - 2009/01/19 (月) 10:13:37 - AP

>確かにニックが入っているのかもしれませんね。
>そうなるとプラスミドの精製からやり直したほうがよいですよね。

実は、ニックは菌内で容易に修復されるので、形質転換にはほとんど影響なかったりします。
長期保存して、cccが全くなくなってOCだけになったようなプラスミドでも形質転換効率は遜色ないです。また、脱リン酸したベクターのligation産物は、原理的に必ずニックが残りますがそれでもworkしているんですから。

ligation/transformationがうまくいかないと、insert/vector ratioだとか、ligation反応の温度だ時間だとか、コンピを変えるとか、いろいろいじって深みにはまってしまう向きがありますが、UVを当てていた場合は、それをやめるだけで、どんなことをするより効果があって問題解決ということ多いですよ。

(無題)

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No.2669-19 - 2009/01/19 (月) 09:46:44 - 石川

>おおさん
アドバイスありがとうございます！！朝早くからお疲れ様です。

私もベクター用のプラスミドを制限酵素処理したあとに、
エタ沈フェノクロ→CIAP処理→エタ沈フェノクロ→ゲル抽
というステップを踏んでいます。

私の理解が足りないのだとは思いますが、
CIAP処理してもゲル抽によって短いフラグメントを取り除かないと、インサートと短いフラグメントがライゲーションする可能性はないのでしょうか？

またコロニー数ですが、申し訳ないことに効率を間違えてました。
10^5コロニー/ngのDH5αで、10ngのDNAを持っていき、リニアになることで2けた効率が悪くなると考えて10^4コロニーできるのが理論的ですが、効率が悪いことでさらにひとけた落ちていると考えました。
1000コロニーだと多いのでしょうか？

(無題)

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No.2669-18 - 2009/01/19 (月) 06:48:59 - おお

>[Re:17] 石川さんは書きました :

> ＞おおさん

> またベクター側でUV照射をショートカットする方法というのは、ひとつの制限酵素で切る時の話でしょうか？
> ２つの制限酵素だとベクター部分と切れ端ができてしまうと思うのですが・・・。

両方です。2種類で切った場合は小さなふらぐめんと
ができますが、これがプラスミドに再挿入されない
ように脱燐酸化をしないと、もとのぷらすみどが、
ゆうせんして、ふえてきます。精製のしかた、大過剰に
インサートをいれる、らいげーしょんのときの
工夫で幾らか抑えられるので脱燐酸かをスキップ
する人もいるようですが、、、

> またTransformaitonではコロニー数は割と多く生えているのですが(1000個程度)、

千個はおおいですね。10ngぐらいつかっているんですよね、、
ちょっとほかも疑った方がいいかもしれません。切出し
などで使っている電気えいどうそうにぷらすみどが
こんたみしているかのうせいはありませんか?
使う前に水洗いでも良いからよく洗っておいた方が
いいですよ。そのほかコンタミのかのうせい
があるぶぶんを考え直してみてはどうでしょうか。
コンピテントはなにもしょりしないでこうせいぶっしつ
いりのぷれーとにまいて、コロニーができるということは
ありませんか?
たまに漢字変換できなくなってます。読みづらくてすいません。

多くのご意見ありがとうございます！！

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No.2669-17 - 2009/01/19 (月) 05:27:48 - 石川

＞APさん
ありがとうございます！！
過去のUVの記述を調べてみます。
またUV照射を5秒以内くらいに抑えてやってみます。

＞ザンギさん
ありがとうございます。
制限酵素処理は２時間、UV照射も５秒以内に抑えてやってみます！！

＞あべちゃんさん
教授にTOPOクローニングについても提案してみます！！
ありがとうございます！！

＞おおさん
確かにニックが入っているのかもしれませんね。
そうなるとプラスミドの精製からやり直したほうがよいですよね。

また今度はUV照射を５秒以内に抑えてやってみたいと思います。

またベクター側でUV照射をショートカットする方法というのは、ひとつの制限酵素で切る時の話でしょうか？
２つの制限酵素だとベクター部分と切れ端ができてしまうと思うのですが・・・。

＞ｙｔさん
やはりUV照射に問題があるのかもしれません。
５秒以内と短くしてやってみようと思います。

ゲルの成分はかなり丁寧にWashもしているのでないとは思います。
またTransformaitonではコロニー数は割と多く生えているのですが(1000個程度)、一応DNAの量を少し下げてみようと思います。

＞DSCさん
そんな方法があるのですね！！
ぜひ今度試してみようと思います！
ありがとうございます。

UVによるDNAの損傷を抑えるために

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No.2669-16 - 2009/01/18 (日) 14:52:09 - DSC

石川さんへの意見というより、広くお勧めしたい方法ですが。

私のラボでは、DNAのゲルからの切り出し時にUVによる損傷を最低限に抑えるために、よく次の方法で行っています（毎年新しく配属された4年生でも安全に高効率で実験を進められるように）。

ゲルをきっちり実物大で撮影できるようにレンズのズームを合わせます（この倍率を頻繁に用いるので、ズームの目盛にシールで目印をつけています）。この状態でゲルにフォーカスを合わせ、UVを照射して画像を撮影します。あらかじめフォーカスが合っていれば、UVを当てる時間は1秒程度で十分なはずです（撮影装置の扱いが頭に入っていないとモタモタするかもしれませんが）。

ベンチの上に写真・ラップ・ゲルの順番で重ね、画像とゲルの輪郭をきっちり合わせます。この状態でズレないように気をつけながら、バンドの位置のゲルを切り出し、精製に進めます。ラップが切れて写真が濡れてしまうこともありますが、データとして保存するのに問題はないでしょう。

この方法だとUVによるDNAのダメージによりライゲーション以降で問題が起きることは皆無のようです。誰でも思いつきそうだから、他でも行われているかもしれませんね。もちろん、慣れた方ならこんな方法を経なくても、トランスイルミネーター上で大したダメージを与えることなく切り出せると思いますが。

(無題)

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No.2669-12 - 2009/01/18 (日) 11:32:57 - ｙｔ

ligationとそれに続くtransformationの失敗で一番多いのは
・切り出し時にＵＶあて過ぎ･･･レーン方向は当てる前に切り込みを入れてし
　まって、バンドの大体の位置に剃刀の刃を立ててそれで初めてＵＶ照射し
　ます。刃からどれくらい離れてるか見るだけなので1-2秒でＵＶを切って、
　剃刀の位置を正しいと思われる位置に立て直して、それで確認のためにも
　う一度一瞬当てるだけです。
・ゲル成分の残留･･･グラスミルクでやってますが、遠心後にゲル成分を含む
　上清を出来るだけ除いてます。その後更にもう一度スピンダウンして残り
　の液を除いて、その後でウォッシュに進みます。Wash後も同様に上清を捨
　てた後更にスピンダウンして液を除いてます。
・transformの時にligation productを入れすぎ･･･入れすぎるとかえって効
　率が悪くなります。

(無題)

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No.2669-11 - 2009/01/18 (日) 02:57:57 - おお

>[Re:6] 石川さんは書きました :
> おおさん、コメントありがとうございます！！

>
> DNAのクオリティーは、QIAGENのQIAEXⅡGel Extraction Kitでゲル抽し、最後はTris-HClに溶かしたDNAをライゲーションに使っています。

DNAの質は精製の度合いよりもむしろニックが入っているか
とかです。プラスミドを切断して見かけ状直さの正しいサイズ
が得られるけど、実はニックがはいっていてズタズタ
と言う事に気がつかないとかいうことはあり得ると思います。

UV照射も質を下げますね。この場合は切れるよりむしろ
塩基に障害があると思いますが。
>
> ちなみにライゲーション後にエタ沈などを挟んでないのですが、そこが原因になっていることはあるでしょうか。そうすると原因がライゲーションではないことになってしまいますが…。

私は直にトランスフォーメーションに持っていってます。
ケミカルですよね、効率から考えて。。。
>

> 一応制限酵素をかなり過剰に入れて(1.5μgに対して10ユニット)反応時間もO/Nしているのですが。

これくらいなら、2、3時間でいいようなきがします。
EcoRIは長時間のしょりは避けた方がいいですね。
>
>
> またトランスフォーメーションでは、以前よりもコンピテントセルの効率が落ちている気がするので、いまは過剰に持っていっています。
> 効率は確か10000コロニー/ngDNAだったので以前は1ngもっていったのですが、いまは10ngもっていってます。

効率はその程度ならたいていだいじょうぶと思います。10^7/ugを基準に考えてます。

総合的に見てUVのあてすぎが第１の原因ではないかと思えます。

>[Re:10] あべちゃんさんは書きました :

>
> コンストラクト作りに、ゲルから切り出すということは、八年くらいやってません。
> ゲルから切り出しという作業は、ベクター作りにおいては、全く不要と考えています。
> 省こうと思えば、省くことができます。
>[Re:6] 石川さんは書きまし
> UV照射は気をつけてみます。

わたしもUV使わないショートカットを使うことがあります。
気分転換にちょっとストラテジーを変えてみてもいいかも
しれませんね。ベクターを切ってから、電気えいどう
せずにCIAPなどで脱燐酸かしてライゲーションとか。

(無題)

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No.2669-10 - 2009/01/17 (土) 20:48:17 - あべちゃん

もしも、どつぼにはまっちゃってるんなら、TOPOクローニングなどライゲースに頼らない方法も候補として考えてみればいいんじゃないですか？

pcDNA3が使いたいなら、ちょうど、TOPO cloning kit使えますよね。
それに、確かお試しで五回分、無料キャンペーンをやっていたはず。
（昨年末、Ｖ５ｔａｇのものをもらいました）

コンストラクト作りに、ゲルから切り出すということは、八年くらいやってません。
ゲルから切り出しという作業は、ベクター作りにおいては、全く不要と考えています。
省こうと思えば、省くことができます。

(無題)

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No.2669-9 - 2009/01/17 (土) 20:13:51 - ザンギ

制限酵素を使ってプラスミド構築するのにスキルの高い人って、この頃は身近にいないんでしょうか。
ほんと、この質問は多いですね。

すでに大御所が回答していらっしゃるので、重箱のすみのほうだけつついておきますと．．．

>一応制限酵素をかなり過剰に入れて(1.5μgに対して10ユニット)反応時間もO/Nしているのですが。

ライゲーション反応に用いるDNA断片は末端が削れると効率が悪くなりますから、過剰な反応は避けるべきです。
EcoRIにはスター活性もありますし。

それとUVは僕は使いますが、照射時間は5秒とかそれくらいで切り出すバンドの上下の位置決めにマークをつける間だけ当ててます。

(無題)

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No.2669-8 - 2009/01/17 (土) 18:24:27 - AP

>UV照射は気をつけてみます。
ちなみにUV被ばくがひどいと、DNAがばらばらになるのでしょうか。
一応ゲル抽後に泳動したときは目的の長さが確認できています。
また一部に変異が入る程度でしたらライゲーションには影響をあたえないきがするのですが。初歩的な質問ですいません。

この辺のことは、過去に何度も取り上げられていますので、皆さんの対策法を含め、探してみてください。

(無題)

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No.2669-7 - 2009/01/17 (土) 18:20:38 - AP

>長波長のUVならDNA損傷はあまりないかと考えてこちらは比較的時間を気にせずあてているかもしれません。それでも2、3分といったところだと思います。

はいー、当てすぎだと思います。
長波長なら安全というのは、あえて言えば嘘です。
長波長はダメージがない（少ない）というのは、どうやらDNAの切断についての話で、RecA-ホストでのクローニングで問題となるピリミジンダイマー形成に対しては短波長と変わらないくらい影響があります。

クローニング目的の切り出しでは、波長にかかわらずUVを全く当てないというのが正解です。UVを当ててバンド位置を確認するレーンと、全く当てずに切り出しに使うレーンを分けるなど、工夫してみてください。

(無題)

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No.2669-6 - 2009/01/17 (土) 18:13:00 - 石川

おおさん、コメントありがとうございます！！

ライゲースの失活ですが、同研究室の人はライゲースできていることと、ライゲースを新しくしてみても変わらなかったです。

DNAのクオリティーは、QIAGENのQIAEXⅡGel Extraction Kitでゲル抽し、最後はTris-HClに溶かしたDNAをライゲーションに使っています。

ちなみにライゲーション後にエタ沈などを挟んでないのですが、そこが原因になっていることはあるでしょうか。そうすると原因がライゲーションではないことになってしまいますが…。

またインサートですが、プラスミドから調整してくるほう(EcoRⅠ＆XhoⅠ)はインサート部分(約2.6kb)と残りのベクター部分(約5.5kb)がバンドではっきり区別できるのでしっかり切れていると思います。
PCR産物からの調整では、XbaⅠサイト側が切れていることを確認する方法がないので切れていないのかもしれません。
一応制限酵素をかなり過剰に入れて(1.5μgに対して10ユニット)反応時間もO/Nしているのですが。

またトランスフォーメーションでは、以前よりもコンピテントセルの効率が落ちている気がするので、いまは過剰に持っていっています。
効率は確か10000コロニー/ngDNAだったので以前は1ngもっていったのですが、いまは10ngもっていってます。

UV照射は気をつけてみます。
ちなみにUV被ばくがひどいと、DNAがばらばらになるのでしょうか。
一応ゲル抽後に泳動したときは目的の長さが確認できています。
また一部に変異が入る程度でしたらライゲーションには影響をあたえないきがするのですが。初歩的な質問ですいません。

(無題)

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No.2669-4 - 2009/01/17 (土) 17:28:16 - おお

ライゲースは失活してませんか?
バッファーのATPがへたっていることも
あるかもしれません。

プラスミドに切れ残りがあったり、切ったあとのマルチクローニング
さいとの部分がコンタミしているなら、pCDNA3(もとのプラスミド)
が取れてくると思いますので、まずはそうではないようにおもえます。

そうするとDNAのクオリティーがわるいか、インサートしようとしている
フラグメントの末端が酵素で切れていないとか、ライゲースが失活している
とかが可能性があると思います。
>[Re:1] 石川さんは書きました :

>
> コロニーは生えているので原因はおそらくライゲーション反応がうまくいっていないのだと思いますが、対策が見当たらなくて困っています。
> どなたかアドバイスをお願いします。

そうとも限りませんよ。適切な量のDNAをくわえて、
適切な効率をもったコンピテントを使っているか
というところも気になります。

(無題)

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No.2669-3 - 2009/01/17 (土) 17:18:12 - 石川

APさんいつも早いコメントありがとうございます。

インサートは

・PCR産物の両端をHindⅢ＆XbaⅠできったもの

・プラスミドからEcoRⅠ＆XhoⅠできったもの

の2種類を用いていますが、どちらもゲル抽出時のUV照射には気を使っています。

具体的には、まず短波長のUVを一瞬当ててバンドパターンを確認し、(１秒ぐらいです)
その後長波長のUVを当てながらゲルを切り出しています。
長波長のUVならDNA損傷はあまりないかと考えてこちらは比較的時間を気にせずあてているかもしれません。それでも2、3分といったところだと思います。

また制限酵素の足場はXbaⅠの足場として5塩基余分に付けています。
HindⅢは端から100bp以上離れているのでとくに足場などはつけていません。