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(無題) 削除/引用 No.2679-22 - 2009/04/18 (土) 20:56:00 - まる >[Re:21] ACさんは書きました : > トランスフェクション試薬をどうかえたとか、どんなプラスミド精製法に変更したのか、差し支えなければ、書いていただけるとみんな幸せになるかなと思いました。 確かにそうですね。 質問しておきながら失礼いたしました。 トランスフェクション試薬のほうはもともとFugene6を使用していましたが polyscience社のPEI MAXに変更しました。 1mg/mLでMQに溶かして使用しています。 ただし無血清培地、HBSS、生食とで希釈液を検討したところ 生食が一番効率がよかったので生食を使用しています。 コマーシャルなPEI試薬で生食だったので問題ないと思います。 原理的にももっとも邪魔なものが少ないですし。 使用方法はFugene6と変わりはないのですが、ポジコンとしておいたはずの Fugene6では発現が確認できませんでした。 少し前までは使用できていたので問題はないかと思うのですが ロットによって効率が悪かったりするという話もあったのでなんとも DNAの精製のほうは、某社のカラムキットを使用していたのをハンドメイドの レジンタイプに変更しました。 キットのほうは遠心機が回転数不足であったためかグアニジンなどの残留が 多かったようです。 LPSなどもあるかもしれません。 あとsol3添加後のステップでサンプルを移し変えたときに大腸菌ゲノムが 遊離していた可能性もあります。 そのあたりが改善されたようです。

具体的に 削除/引用 No.2679-21 - 2009/04/17 (金) 18:55:36 - AC トランスフェクション試薬をどうかえたとか、どんなプラスミド精製法に変更したのか、差し支えなければ、書いていただけるとみんな幸せになるかなと思いました。

解決しました(たぶん？) 削除/引用 No.2679-20 - 2009/04/01 (水) 11:43:00 - まる 結局トランスフェクション試薬の変更と、プラスミド精製法を変更したところ 弱くはありますが293で発現確認できました。 問題点はトランスフェクション効率と検出試薬がメインだったようです。 バンドの位置も思ったより高くなっていて今までIPのノンスペだと思っていた バンドがそうでした。 ただ、今度は入りすぎなのか細胞がはがれていってしまいますが…。 お手数おかけしました。

ありがとうございます 削除/引用 No.2679-19 - 2009/01/26 (月) 11:40:21 - まる >[Re:18] おおさんは書きました : > たしか発現確認にRIPAを使ってたと思いで、抽出のロスは少ないとおもいますが、、、 私もRIPAなので問題ないと思ったのですが、調べてみるとRIPAでも会社ごとに組成が違ったりしてびっくりしました。 以前の研究室はSIGMAの組成だったようです。 > いい発現系、方法が見つかれば良いのですが、代替案として、 > ライセーとをたくさん取って(多分エンドでいいので > 導入せずに)、イオン交換とかゲル濾過など1本カラム > に通して、各フラクションをウエスタンして、両者 > が一緒に出てくるフラクションをさがす。 > 得られたフラクションから、IPして結合の裏をとる > というアプローチも取れるかと思いました。 > どうしてもタグというならばステ-ブルでもいいかもしれません > でも若干時間がかかりますね。 確かにカラム濃縮という手がありました。気づきませんでした。 ただ以前所属していた研究室と違って主にin vivoの毒性評価の教室のため、 そういったモノがありません。 イオン交換もゲル濾過も自分で機械を触ったことはなく、人にやってもらったので使い方がわからないです…。 ゲル濾過だと全部流して複合体形成によるシフトなども評価できて当たりもつけられそうでいいですね〜。 ほんとにいい発現系がほしいです…。 どうしようもなかったらエンドIP用ので抗体買ってもらいます。 それでIPしている論文は結構あるので問題ないみたいですね。 >[Re:17] MKさんは書きました : > 単純な発現量の問題だけではなく、細胞からの抽出効率やSDS-PAGEでの問題も考えられるということですね。でしたらそちらを先に解決したほうがいいですね。 > > 抽出段階や泳動段階でゲノムDNAが問題なのであれば抽出する際に1%SDS、400mM NaCl位のlysis bufferで抽出すればゲノムが抽出されて粘性を持つ溶液になります。そのままでは泳動できないのでSonicationでゲノムを断片化すれば泳動可能になります。ヒストンなどが大量に抽出されてしまうので泳動に用いるタンパク量はかなり多めにする必要があります。超音波処理でタンパク質複合体が壊れてしまう可能性があるので相互作用因子等を調べるのには不向きですが、目的のタンパク質の発現を確認したり、泳動の際の問題を解決するだけなら大丈夫だと思います。目的のタンパク質がばらばらに切断されて見えなくなってしまうということもないと思います。 > > それで発現が確認でき、もっとマイルドに抽出する必要があるのであればDNase等の処理後に抽出すればタンパク質複合体を壊さずにクロマチンフラクションのものをとってこれると思います。 可溶化については2X sample bufferを使って溶かしている方がいらっしゃったので、それを参考に一度泳動に問題がないか確かめました。 確かに超音波処理するとさらさらになってびっくりしました。 以前の研究室にはなかったので… 現在Transfection試薬が切れて、ほかの試薬への移行を検討しているので すぐにできるわけではないのですが、最適条件が決まり次第試してみたいと思っています。 DNAへの巻き込みで解決されればいいのですがそうすると本当にDNase処理後IPといった形になりそうです。 シリンジでだけでもDNAは切れるといった事を聞いたことがあるのでそちらも含めて検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2679-18 - 2009/01/26 (月) 04:01:28 - おお >[Re:17] MKさんは書きました : > 単純な発現量の問題だけではなく、細胞からの抽出効率やSDS-PAGEでの問題も考えられるということですね。でしたらそちらを先に解決したほうがいいですね。 > > 抽出段階や泳動段階でゲノムDNAが問題なのであれば抽出する際に1%SDS、400mM NaCl位のlysis bufferで抽出すればゲノムが抽出されて粘性を持つ溶液になります。 たしか発現確認にRIPAを使ってたと思いで、抽出のロスは少ないとおもいますが、、、 いい発現系、方法が見つかれば良いのですが、代替案として、 ライセーとをたくさん取って(多分エンドでいいので 導入せずに)、イオン交換とかゲル濾過など1本カラム に通して、各フラクションをウエスタンして、両者 が一緒に出てくるフラクションをさがす。 得られたフラクションから、IPして結合の裏をとる というアプローチも取れるかと思いました。 どうしてもタグというならばステ-ブルでもいいかもしれません でも若干時間がかかりますね。

(無題) 削除/引用 No.2679-17 - 2009/01/26 (月) 02:19:39 - MK 単純な発現量の問題だけではなく、細胞からの抽出効率やSDS-PAGEでの問題も考えられるということですね。でしたらそちらを先に解決したほうがいいですね。 抽出段階や泳動段階でゲノムDNAが問題なのであれば抽出する際に1%SDS、400mM NaCl位のlysis bufferで抽出すればゲノムが抽出されて粘性を持つ溶液になります。そのままでは泳動できないのでSonicationでゲノムを断片化すれば泳動可能になります。ヒストンなどが大量に抽出されてしまうので泳動に用いるタンパク量はかなり多めにする必要があります。超音波処理でタンパク質複合体が壊れてしまう可能性があるので相互作用因子等を調べるのには不向きですが、目的のタンパク質の発現を確認したり、泳動の際の問題を解決するだけなら大丈夫だと思います。目的のタンパク質がばらばらに切断されて見えなくなってしまうということもないと思います。 それで発現が確認でき、もっとマイルドに抽出する必要があるのであればDNase等の処理後に抽出すればタンパク質複合体を壊さずにクロマチンフラクションのものをとってこれると思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.2679-16 - 2009/01/24 (土) 16:36:34 - まる >[Re:15] おおさんは書きました : > 核内にあるものをターゲットにするのであれば、サイトゾルを除いた > フラクションで抽出すると見かけ上(総タンパク量あたりのシグナル)、 > 強くなる可能性はたかいです。 私もそれに関連したことで考えていました。 通常AhRはサイトゾルにいるのですが、コンフルになるとリガンド結合と 別経路で活性化されて核内に移行するそうです。 問題はその後なのですが、DNAに結合しているAhRはLysisしたあと遠心すると DNAに巻き込まれて不溶性画分にいく可能性、DNAとアグってゲルトップで とまる可能性、GPCRのように高温boilでアグる可能性などです。 強くはないのですが、stable化したときにゲルトップ付近にtag抗体で 検出できるバンドがみられました。 ただ、発現量がすべてのクローンで同程度なのでバックを疑いました。 が、もしかしたらモノかもしれません。 以上の点を改善すれば発現は確認できるようになるかもしれないのですが、 今回の実験ではサイトゾルで結合している分子、核内で結合している分子 の両方をみたい、核への移行がみたいのでどちらかのフラクションだけ というわけにはいかないのです。

(無題) 削除/引用 No.2679-15 - 2009/01/23 (金) 13:29:10 - おお 核内にあるものをターゲットにするのであれば、サイトゾルを除いた フラクションで抽出すると見かけ上(総タンパク量あたりのシグナル)、 強くなる可能性はたかいです。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2679-14 - 2009/01/21 (水) 23:57:05 - まる >[Re:13] MKさんは書きました : > それぞれのtagのコンストラクトからのmRNAの発現量を比較したことはあるでしょうか？そこで差があれば転写効率の問題で、そうでなければ翻訳後の安定性を疑うことになると思います。 確かにみておりませんでした。 RT-PCRで確認するということでよろしいでしょうか？ > 核内受容体とのことですので内在性のリガンドとの結合によりプロテアソームによる分解を受けていることは考えられないでしょうか？MG132等の阻害剤の添加で確認してみてはどうでしょう？ > > もしくは何かのタンパク質と複合体を形成していないと安定しないようなタンパク質であるということは考えられないでしょうか？AhRはARNTと結合するヘテロ二量体型の核内受容体だったと思うので両方発現させてやらないと安定化しないということは考えられないでしょうか？ 普段はHSP90やXAP2といったタンパクと結合しており、安定なようです。 活性化後分解されるということでした。 MG132の添加で確認できるかもしれないのですが、 MG132の添加はAhRの活性を機序不明で殺してしまうようです。 TK-1さんの話によると発現するのが正常なのかもしれません。 >[Re:12] DNAIさんは書きました : > > myc-tagについても調べてみたのですがmyc-tagには複数あるのでしょうか？ > 私が使用していた配列はSIGMAのc-Myc(EQKLISEEDL)です。N-termの分泌シグナル以降に挿入していました。 > 抗体の性能としては、バックグラウンドを同程度にした条件では、やはり抗FLAGタグ抗体が一番強く、抗Myc（9E10)はやや劣るという印象です。 > 論文でMycが最も発現が高いとのことでしたが、その他の論文と比較して > 抗体添加量やＷＢ検出系に違いはないでしょうか。ECLにしてもplus,Advanceと劇的に検出感度が向上しますからね。 V5、flagでの検出が一応できています。 ただしM2に関してはおろしたてだったのでバックとバンドががぶっていました。 論文ではpierce社のSuperSignal West Dura Extended Duration Substrate を使っているようですが抗体濃度は特別濃くはないようでした。 ECL plusに相当する物のようです。 9E10が1:10000でanti-mouseが1:5000でした。 ECLの感度は私とは異なるようです。 ただし私の抗体の条件が濃度が濃いので論文の方が4-5倍上？位だと思われます。

(無題) 削除/引用 No.2679-13 - 2009/01/21 (水) 19:32:03 - MK それぞれのtagのコンストラクトからのmRNAの発現量を比較したことはあるでしょうか？そこで差があれば転写効率の問題で、そうでなければ翻訳後の安定性を疑うことになると思います。 核内受容体とのことですので内在性のリガンドとの結合によりプロテアソームによる分解を受けていることは考えられないでしょうか？MG132等の阻害剤の添加で確認してみてはどうでしょう？ もしくは何かのタンパク質と複合体を形成していないと安定しないようなタンパク質であるということは考えられないでしょうか？AhRはARNTと結合するヘテロ二量体型の核内受容体だったと思うので両方発現させてやらないと安定化しないということは考えられないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2679-12 - 2009/01/21 (水) 09:14:36 - DNAI > myc-tagについても調べてみたのですがmyc-tagには複数あるのでしょうか？ 私が使用していた配列はSIGMAのc-Myc(EQKLISEEDL)です。N-termの分泌シグナル以降に挿入していました。 抗体の性能としては、バックグラウンドを同程度にした条件では、やはり抗FLAGタグ抗体が一番強く、抗Myc（9E10)はやや劣るという印象です。 論文でMycが最も発現が高いとのことでしたが、その他の論文と比較して 抗体添加量やＷＢ検出系に違いはないでしょうか。ECLにしてもplus,Advanceと劇的に検出感度が向上しますからね。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2679-11 - 2009/01/20 (火) 22:53:47 - まる >[Re:10] TK-1さんは書きました : > AhRなら、うちのラボでHEK293でCo-IPやってますが特に問題がないようです。Full-lengthもPAS-B deletionも同じような感じです。retroでprimary cellにも入れていますが、それでも発現の検出には特に問題がないようです。問題と言えば、Delta-PASを入れたり、FULL-lengthを入れてFICZをいれてやると、うまくやらないと導入細胞だけが死んでしまいます。 本当ですか！？ ちなみにtagは何を使用されているのでしょうか？ tagとは関係ないのでしょうか？ >[Re:9] おおさんは書きました : > Co-IPで相互作用をみるなら、IPとWBの検出を逆にする手もある > はずですが、多分お気づきでしょうね。 逆落としはさらに効率が悪かったのです。 > もう一つそんなにいい案ではないですが、いきなりドメインダイセクション > をしてしまうというのはどうでしょうか、安定性にかかわるドメインが割り出せる > かもしれませんし、それを偶然でもいいからさけると言うのが狙いです。 確かにそうですね。 ただ使用する化合物がどこに結合するのかがいまいち不明なため、手を出せそうにありません。 > ライガンド結合、分解の経路に少し注目してそれをブロックできるような > ことができればいいかもしれませんが、、、、この辺も無知ということで > それ以上は書きません。 実験の目的上inhibitorの使用は困難なのです…。

http:// 削除/引用 No.2679-10 - 2009/01/20 (火) 21:48:34 - TK-1 AhRなら、うちのラボでHEK293でCo-IPやってますが特に問題がないようです。Full-lengthもPAS-B deletionも同じような感じです。retroでprimary cellにも入れていますが、それでも発現の検出には特に問題がないようです。問題と言えば、Delta-PASを入れたり、FULL-lengthを入れてFICZをいれてやると、うまくやらないと導入細胞だけが死んでしまいます。

(無題) 削除/引用 No.2679-9 - 2009/01/20 (火) 16:40:24 - おお >[Re:8] まるさんは書きました : > おおさん > ＞ちなみにクロンテックはエピトープぶいはMQKLLSEEDL > クロンテックの物はMASMEQKLISEEDLとしてるみたいでした。 あ、１残きおとしてた、、、あまたのMASは多分エピトープというよりは、翻訳開始に都合のいいものを持ってきたのだと思えます. > 残念なことにAhRは刺激で分解されてしまうのです… すみません。ひらめいたと思ったのですが、、、無知なだけでした。 じゃあ、アンタゴニストはと悪あがきしてみる。 存在しないかもしれませんね。 でもなんかライガンドがなくても半減期は短そうです。 > はじめはそのつもりで研究室にある抗体でIPしたのですがIP効率の良くない > 抗体みたいでIPしてもLysateと同じくらいしか回収できませんでした。 Co-IPで相互作用をみるなら、IPとWBの検出を逆にする手もある はずですが、多分お気づきでしょうね。 > あと発現量は抗体価にもよるのでなんともいえないです。 やはりそういうことなんですね。 もう一つそんなにいい案ではないですが、いきなりドメインダイセクション をしてしまうというのはどうでしょうか、安定性にかかわるドメインが割り出せる かもしれませんし、それを偶然でもいいからさけると言うのが狙いです。 ライガンド結合、分解の経路に少し注目してそれをブロックできるような ことができればいいかもしれませんが、、、、この辺も無知ということで それ以上は書きません。

ありがとうございます 削除/引用 No.2679-8 - 2009/01/20 (火) 15:27:19 - まる おおさん ＞ちなみにクロンテックはエピトープぶいはMQKLLSEEDL ＞の部分でオリジナルのエピトープEQKLISEEDLをモディファイ ＞しているようです。特許がらみなのかな、、、 クロンテックの物はMASMEQKLISEEDLとしてるみたいでした。 先ほど電話で問い合わせたところ発現量が上がるかららしいです。 ちなみに論文では付加しているアミノ酸配列だけは記載してあったのでtagは 1xだと思われます。 ＞核内レセプターということなので、ライガンドを加えると安定化するとか ＞ないでしょうか。あと肝細胞はセルラインはアルブミンさえ発現しませんか ＞ら、だいぶvivoと違うでしょうね。 残念なことにAhRは刺激で分解されてしまうのです… ＞GFPの発現で同程度位まで何とかなり、内在性のものが強く発現しているなら ＞さほど悪くはないのでは? ＞いっそのこと内在性の物をIPした方がスッキリしませんか? はじめはそのつもりで研究室にある抗体でIPしたのですがIP効率の良くない 抗体みたいでIPしてもLysateと同じくらいしか回収できませんでした。 IPのためだけに抗体を買うのもありでしたがだめかもしれない事を考え、 どうせ買うなら汎用性のある抗体の方がいいことと、安全策としてとで 強制発現を選択しましたが裏目に出てしまったようです。 あと発現量は抗体価にもよるのでなんともいえないです。 蛍光顕微鏡で観察できはしてもデータにするには少なすぎてバックがひどいことになってしまうので。

(無題) 削除/引用 No.2679-7 - 2009/01/20 (火) 15:08:07 - おお あっそうか、N末だとそのスタートコドンあたりの翻訳開始の効率 の違いが出るのかなぁ。でよく発現する場合はさがあっても、見過ごして るかもしれない。mycやflagは6xとか3xとかあってかなり高感度で検出 できるものもあるし、、 核内レセプターということなので、ライガンドを加えると安定化するとか ないでしょうか。あと肝細胞はセルラインはアルブミンさえ発現しませんから、 だいぶvivoと違うでしょうね。 ちなみにクロンテックはエピトープぶいはMQKLLSEEDL の部分でオリジナルのエピトープEQKLISEEDLをモディファイ しているようです。特許がらみなのかな、、、、 モノクロの9E10はこのエピトープぶいを認識しその種間のバリエーション から人特異的な抗体になっています。COSですら反応しません。 たしか違うクローンの抗体でつかえるやつもあったと思います Cell signalingだったかな、そっちのほうが強いかもとちょっと 思ったりします。 ＞発現が得られないのは多分そのたんぱく質の性質によるものではないかと思 ＞います。 >組織局在もユビキタスで、内在性のものもかなり発現しており、内在性のも >のは強烈に検出できるので安定性にはさほど問題はないと考えております。 >同時にGFP付のタンパクで内在性の物と量を比較したところ同程度かそれ >以下でした。 GFPの発現で同程度位まで何とかなり、内在性のものが強く発現しているなら さほど悪くはないのでは? いっそのこと内在性の物をIPした方がスッキリしませんか? Tantigen/SV40oriの組み合わせというてもあるかもしれません。

ありがとうございますその２ 削除/引用 No.2679-6 - 2009/01/20 (火) 11:47:20 - まる DNAI様 ＞基本構造が同じベクターを用い、タグのみFLAG,Mycで数十ターゲットを ＞発現させておりますが、Mycコンストラクトの方が発現が明らかに高い ＞ケースが数例ありました。 私もおおさん同様tagとの相性なんてあり得ないと思っておりました。 しかしながら唯一myctag使用の論文だけIPなしで強烈に発現していたので まさかと思い質問するに至った次第です。 タンパクによっては配列を変えることで発現量を格段に上げて精製をしやすく するという話もあるので論文の引用先をみてみたのですがただのクローニングの論文で、そのようなことは触れておりませんでした。 さらに唯一発現の確認できている論文はcDNAも供与らしく、おそらくはnativeの配列の物を使用していると思われます。 myc-tagについても調べてみたのですがmyc-tagには複数あるのでしょうか？ clontechとinvitrogenでは配列が違うのですが。 ちなみにclontechに聞いてみても他社と同じくヒト由来であるという返答が 返ってきたのですが、開始メチオニンを削除してもマッチしませんでした。 今のところ由来不明です。 どちらが一般的なのでしょうか？ 長くなって制限を超えてしまったので二つに分けました。 長々と書いてしまい、読みにくく手申し訳ないですが返答いただければ幸いです。

ありがとうございますその１ 削除/引用 No.2679-5 - 2009/01/20 (火) 11:46:08 - まる 早速のご回答ありがとうございます。 うーん様 ＞タンパク名を挙げるのはいかがですか？ ご指摘の通りですね。 AhRという核内受容体です。 ごく少量ですがwesternの検出条件をいじれば検出ができるので 発現はしていると思われます。 おお様 ＞一過性の過剰発現ですよね。 ＞例えばGFPタグでトランスフェクション後、顕微鏡でGFPのシグナルが ＞確認できますか?その場合なん%の細胞がポジに見えますか? 蛍光顕微鏡では確認はできていますが、発現量が低いのか検出感度が低いのかうまくデータにできる量ではありませんでした。 タイムラプスで行いたかったので細胞培養器付きの顕微鏡なのですが、共通機器には培養器がなければもう少し感度がいい物があるそうです。 ポジの数については2-3割です。cell lineはHepG2、Hepa1です。試薬Fugene6なので商品説明の通りかと思われます。 ＞IPできるようなバッファーであればもしかしたら、可溶化がその条件で ＞できないで、ウエスタンで検出できないということはありませんか。 発現チェックはRIPAで、IPは別の物を使用しているので可溶化に問題はないと思われます。 ＞例えばHEKにリン酸カルシウムでいれると、やばいほど一過性に発現が ＞あがります。 これも聞いたことがあるのですが自分でやったことがなく、使い慣れた試薬を使っています。 どうもbufferのできによって入り方が変わったり、場合によってはCaによっても変化するといったこと、リンカルができてた人が別の教室で行うと入らなくなったとかいう噂があったので手を出していません。 単にHEKがへたってるだけということも考えられますが。 実際知り合いの方に供与してもらったHEKがひどかったので別に取り寄せました。 実際はどうなのでしょうか？おすすめの会社などあれば教えていただきたいのですが。ちなみにFugene6でHEKに別のタンパクを発現させると大量に発現するのでvector側の問題ではないかと考えております。 >生理的にあり得ない程の発現がえられるので、慎重な対応が >必要なぐらいです(うちのボスは危ないくらいすきです)。 >言いたいことは発現系統を変えて見ればどうか >ということです。細胞によってはよく発現したり、あるいは分解 >が遅かったりというのは十分にあり得ます。 私自身も以前所属していた研究室で生理的かいなかについてボスと大げんかしたことがあります。ただCo-IPを行いたいのである程度の発現量がほしいことと、内在性のAhRの発現量が高いことがあるので少々強めでほしいところです。 生理作用というよりは結合実験なので、別に大腸菌で精製してもいいのですが 今いる研究室はvitroはやっていないので機材がなく、なぜか所持している細胞培養器を使用している次第です。 ＞発現が得られないのは多分そのたんぱく質の性質によるものではないかと思 ＞います。 組織局在もユビキタスで、内在性のものもかなり発現しており、内在性のものは強烈に検出できるので安定性にはさほど問題はないと考えております。 同時にGFP付のタンパクで内在性の物と量を比較したところ同程度かそれ以下 でした。 ほかのtagではフォトショでいじってぎりぎり見えるレベルでした。

(無題) 削除/引用 No.2679-4 - 2009/01/20 (火) 09:10:41 - DNAI タグとの相性、これはレアケースでありますが顕著な発現の差異が認められることがあります。 基本構造が同じベクターを用い、タグのみFLAG,Mycで数十ターゲットを発現させておりますが、Mycコンストラクトの方が発現が明らかに高いケースが数例ありました。 細胞、解析法は統一しておりますので、タグとの相性は少なからずあるのかもと考えております。 一度Mycタグコンストラクトを作製されてはいかがですか。 最も、発現が高いからといってそれでいいのかというのはおおさんの御指摘通りです。

(無題) 削除/引用 No.2679-3 - 2009/01/20 (火) 08:21:11 - おお 一過性の過剰発現ですよね。 例えばGFPタグでトランスフェクション後、顕微鏡でGFPのシグナルが 確認できますか?その場合なん%の細胞がポジに見えますか? IPできるようなバッファーであればもしかしたら、可溶化がその条件で できないで、ウエスタンで検出できないということはありませんか。 例えばHEKにリン酸カルシウムでいれると、やばいほど一過性に発現が あがります。そういう意味でこの系は結構使われていますが、 生理的にあり得ない程の発現がえられるので、慎重な対応が 必要なぐらいです(うちのボスは危ないくらいすきです)。 言いたいことは発現系統を変えて見ればどうか ということです。細胞によってはよく発現したり、あるいは分解 が遅かったりというのは十分にあり得ます。 基本的にタグとの相性で発現が悪くなるというのは あまりないと思います。どのタグを入れても強い 発現が得られないのは多分そのたんぱく質の性質によるもの ではないかと思います。

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