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みなさまありがとうございました。 削除/引用 No.2507-15 - 2010/06/08 (火) 03:09:30 - hono えさんのおっしゃるように細胞をトリプシンで処理後、トリプシンインヒビター入りPBSで回収、遠心し、普通のPBS(-)で洗いました。 細胞はよくボルテックスしてから、３匹分ずつ用意して静注しました。 ２ｘ１０＾６の注射でマウスはみな無事でした。 やはりトリプシンインヒビター処理が効いたようです。 本当にどうもありがとうございました。

もう解決されたでしょうか 削除/引用 No.2507-14 - 2010/05/23 (日) 16:05:46 - ant 検討違いかと思いますが、空気が入った場合にも同様の症状で死にます。 ご参考までにお伝えしました。

(無題) 削除/引用 No.2507-13 - 2010/05/12 (水) 11:52:40 - ＡＡＡ 私も幹細胞をｉｖしたことがありますが、やはり１＊１０の６乗では 死亡することが多かったですね。既報ではよく１＊１０の６乗を使わっているので不思議ではありますが、、 ５＊１０の５乗で問題いけました。ご参考までに。。。

(無題) 削除/引用 No.2507-12 - 2010/05/11 (火) 14:27:05 - hono >えさん どうもありがとうございます。 ご指摘の通りだと思います。確かにトリプシンを処理してないときは遠心後にダマができやすく、細胞が融けたようになっているように思いました。 これはまずいですね…。 さっそくトリプシンインヒビター（大豆由来）を注文してみました。 どうも色々な種類があるようですね。 invitrogenのTrypsin neutralizerはPBSに0.5%のBSAが含まれたもののようでした。なので、PBSにBSA加えるだけでもいいのかもしれないですね。 とりあえず、えさんのおっしゃる方法でwashをしてから、セルストレイナーに通そうと思います。EDTAで剥がれるかどうかも試してみようと思います。 試した後、またこちらで報告をさせていただこうかと思います。 こちらで聞いてみて、きちんと考えて実験しないといけないなと実感しました。 みなさま、色々とどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2507-11 - 2010/05/10 (月) 09:32:26 - え >えさん > トリプシンの中和はされていますでしょうか？ > そのPBSにtrypsin inhibitorが入っているのでしょうか？ ご指摘どうもありがとうございます。トリプシンの中和はしていませんでした。もしかしてこれが一番の原因なのかもと思いましたが、以前うちのラボで静脈注射をしていた人によるとインヒビターの入っていないPBSでwashしていたようです。それで問題はなかったようなのですが、入れた方が良さそうですね…。 トリプシンを使用しないときは具体的にどのようにされていましたか？PBS(-)でのwashを繰り返すなどでしょうか？初歩的なことかもしれませんが、もしよろしければ教えていただけますか？ それはまずいと思います。 普通、接着細胞をトリプシンEDTAで処理後、PBSなどで薄めて遠心するとおそらく細胞は死滅しませんか？私は大学院に入り始めの頃、それを（トリプシンを中和しないこと）して遠心するとDNAが出てきました。教授に酷く怒られました。 もしhonoさんがトリプシン処理後、FCS入りのmediumで中和することを避けたいのであれば、トリプシンの中和のためにお使いのPBSに「アンチトリプシン」を入れて、遠心することをおすすめします。 さらに続けてアンチトリプシンfreeのPBSで洗えば、いいのではないでしょうか？ ちなみに、、EDTAなどでは細胞は剥がれませんか？ うちのlabでは転移実験でトリプシンの使用を避けています。私はその辺、門外漢なので少し興味があります。

(無題) 削除/引用 No.2507-10 - 2010/05/10 (月) 07:39:39 - hono >通りすがりさん どうもありがとうございます。 　参考にさせていただきます。 >えさん > トリプシンの中和はされていますでしょうか？ > そのPBSにtrypsin inhibitorが入っているのでしょうか？ ご指摘どうもありがとうございます。トリプシンの中和はしていませんでした。もしかしてこれが一番の原因なのかもと思いましたが、以前うちのラボで静脈注射をしていた人によるとインヒビターの入っていないPBSでwashしていたようです。それで問題はなかったようなのですが、入れた方が良さそうですね…。 トリプシンを使用しないときは具体的にどのようにされていましたか？PBS(-)でのwashを繰り返すなどでしょうか？初歩的なことかもしれませんが、もしよろしければ教えていただけますか？ >さとしさん 　そのようなものもあるのですね。ありがとうございます。

雑談になりますが 削除/引用 No.2507-9 - 2010/05/08 (土) 12:33:07 - さとし 話がそれるかも Mouse serum albminも売っているので BSAより良いかもしれませんね。 勝手な想像です(^^;

(無題) 削除/引用 No.2507-8 - 2010/05/07 (金) 17:04:41 - 通りすがり > 　BSAが凝集抑制になるとは知りませんでした。 > 　えさんのおっしゃるように、私もBSAの影響について知りたいです。 > 　セルストレイナーならすぐに出来そうですね。 細胞種にもよりますが、蛋白を全く含まないbufferなどでは非常に凝集しやすい細胞もあります。そうした細胞に対してはBSA添加は非常に効果的です。 実験系の検討のため最初にBSAのみをi.v.したことがありますが、特にマウスが死亡したりということはありませんでした。 セルストレイナーを通す過程はどこかで必ず入れられることを強くお勧めします。この１手間で結果が大きく改善した経験がありますので。

(無題) 削除/引用 No.2507-7 - 2010/05/06 (木) 15:05:25 - え >トリプシン処理後のwashをPBSで行っているのですが、メディウムを使ってwashして最後の調整だけPBSで行った方がいいのかなと思っているのですが、どうでしょうか？ >LLCを静注したことのある方がいらっしゃると嬉しいです。 LCCというのはlewis lung cancerのことでしょうか？私のlabでもトピ主さんと同数の細胞をマウスにi.vしてる人がいます。肺塞栓などでやはり死ぬ事もあるようですね。 ひとつ確認してもよろしいでしょうか？ トリプシンの中和はされていますでしょうか？ そのPBSにtrypsin inhibitorが入っているのでしょうか？ ちなみに私のlabでのprotocolは、トリプシン処理はしないようです。 なぜならi.vで転移させても接着分子等がトリプシンで壊されてしまい、転移効率が悪くなる事を危惧して、とのことです。トリプシンを使わないとアグリやすいので、そこは十分セルストレイナーでシングルセルだけを打ち込むように気を遣わねばないませんね。

(無題) 削除/引用 No.2507-6 - 2010/05/06 (木) 14:49:30 - hono >テトラポさん > お使いの細胞種が何かを書かれた方が答えが得られやすいかと思います。 > また、どうしてもIVでなければならない理由がないならば移植部位の変更をオススメします。 　使用している細胞はLLCです。凝集しやすい細胞なのでしょうか？ 　はがす方法についての検討も必要なのですね。トリプシン処理後のwashを　　PBSで行っているのですが、メディウムを使ってwashして最後の調整だけ　　PBSで行った方がいいのかなと思っているのですが、どうでしょうか？ 　LLCを静注したことのある方がいらっしゃると嬉しいです。 > ECVAMの手引き（2000年版）によるとマウスのIV投与容量は5mL/kgとのこと です。 　投与量についても検討してみようと思います。 　希釈するだけでは意味がないのかもしれないですね・・・。 >通りすがりさん > 凝集阻止のため0.1%のBSAを添加したPBS(-)で細胞を調整し、調整後の細胞は投与直前までon iceで冷やしておりました。 > BSAは実験系によっては結果に影響する可能性が否定できませんが、 > 細胞によっては添加によって凝集を効果的に抑制できます。 > 後は細胞数カウントの前に必ずセルストレイナーを通しておりました。 　BSAが凝集抑制になるとは知りませんでした。 　えさんのおっしゃるように、私もBSAの影響について知りたいです。 　セルストレイナーならすぐに出来そうですね。 　 >　Bostonさん > 細胞は肺静脈に集中しやすいらしく、窒息死すると聞いた事があります。１０の５乗程度なら問題なかったです。 　細胞数はできれば１０の６乗討てればいいなと思っています。やはりセルストレーナーとすぐに注射するということが大事なのですね。 みなさまどうもありがとうございます。 引き続き何か良い方法があればよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2507-5 - 2010/05/06 (木) 14:20:25 - Boston Bone marrow 由来 mesenchymal stem cells を尾静脈注射していました。細胞は肺静脈に集中しやすいらしく、窒息死すると聞いた事があります。１０の５乗程度なら問題なかったです。凝集しやすい細胞は、セルストレーナーに通して、直ちに注射する必要があります。細胞種によると思いますが、参考までに。

(無題) 削除/引用 No.2507-4 - 2010/05/06 (木) 12:14:12 - え BSAですか…凝集阻止剤としてわからなくもないですが、アロreactionが起きますので それでショック死などしないか逆に知りたいです。

(無題) 削除/引用 No.2507-3 - 2010/05/06 (木) 12:03:44 - 通りすがり 同様の実験経験があります。 私が実施したときは凝集阻止のため0.1%のBSAを添加したPBS(-)で細胞を調整し、調整後の細胞は投与直前までon iceで冷やしておりました。 BSAは実験系によっては結果に影響する可能性が否定できませんが、 細胞によっては添加によって凝集を効果的に抑制できます。 後は細胞数カウントの前に必ずセルストレイナーを通しておりました。

(無題) 削除/引用 No.2507-2 - 2010/05/05 (水) 16:04:10 - テトラポ 細胞の適切な剥離条件は細胞ごとに異なるので、細胞をはがす際の密度やトリプシン処理の時間などを振って最適化するのがよろしいかと思います。 私も細胞によっては移植前にアグッてIVすると死ぬことがあり、はがす方法を変えるとバラバラになりちゃんと移植できることがありました。 お使いの細胞種が何かを書かれた方が答えが得られやすいかと思います。 また、どうしてもIVでなければならない理由がないならば移植部位の変更をオススメします。どうせアグる細胞を血中に移植しても血中を循環しつつ増えるわけではなくどこかに固まるでしょうから。 因みに当方はIV移植は25〜27G注射針を用い、移植する容量は100uLとしています。 ECVAMの手引き（2000年版）によるとマウスのIV投与容量は5mL/kgとのことです。

マウスの尾静脈に投与する細胞の調整について 削除/引用 No.2507-1 - 2010/05/05 (水) 13:33:44 - hono いつもこちらで勉強させていただいています。 今回初めて投稿させていただきます。 よろしくお願いいたします。 現在、実験で使用するためマウスの尾静脈内から細胞を注射しています。 尾静脈内投与自体は成功するのですが、 投与後数秒してマウスが痙攣を始め、呼吸困難に陥り死亡してしまいます。 前回行ったときは10匹中5匹が死亡しました。 原因として細胞をＰＢＳ中にサスペンションしているため、細胞が凝集してしまうためかと考えています。細胞を調整後、数分で細胞の凝集塊が見られます。 そのため、シリンジにとる前に何度か針（３０Ｇ）で出し入れしたり、ピペッティングをしています。 また、前回は調整した細胞に１ｍＭのＥＤＴＡを加えましたが、それほど改善したようには見えませんでした。 細胞の調整方法は 　・Ｔ１２５フラスコで培養した細胞をトリプシン処理して回収 　・ＰＢＳを加え細胞数を調整：前回は1匹目が1.5ｘ10＾6/200ulで 死亡したため、細胞数を1x10＾6/300ulに変更しましたが、それでも死亡　　しました。 細胞調整後、投与までにかかる時間を出来る限り短くするため3匹分ほど用意してから調整しなおしています。 細胞が凝集しないための工夫が何かあれば伺いたいなと思い、トピックを立てさせていただきました。死亡率が高すぎる気がするのですが、皆様はどのように細胞を調整されていますか？ 全く検討違いのことを言っていて、何か別のところに原因がありそうでしたらご指摘をどうぞよろしくお願い致します。

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