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(無題) 削除/引用 No.998-9 - 2009/08/12 (水) 01:13:35 - おお >[Re:8] ばくてりあさんは書きました : > ＞おおさん > 粉をぶち込むのも考えたのですが、混ぜて溶かす間に湖水中の環境が劇的に変わりそうな気が… > > 湖水自体をRNA精製用D solにするというのはよさそうですね。 > ところで、Dsolとはなんでしょうか？毒性のあるものだとしたら、作業が大変な気がします。 //lorylab.med.harvard.edu/documents/huRNAextraction.pdf (http:を頭に補ってください) ここのSOLUTION Dのような液です。 若干バリエーションがあるかもしれません。 精製としては、酢酸ナトリウムをくわえ、フェノールを加え クロロフォルムを加えると、、、、まあ有機溶媒を使いますので 最近は敬遠されている方法だと思います。 LiClの入った溶液でまずRNAを沈殿させる方法も精製で使われたりしますね。 バクテリアからこの方法で精製というのを見たことがあります。 あとはこういうのもあります //catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?catcd=B1000354&subcatcd=B1000356&unitid=U100003441 //catalog.takara-bio.co.jp/product/tech_info_detail2.asp?catcd=B1000354&subcatcd=B1000356&unitid=U100003441&masterid=M100001917 微量を効率よく精製できるかちょっと分かりませんが、、、、 キャリアーとかなにか考えないといけないかもしれません。

情報ありがとうございます 削除/引用 No.998-8 - 2009/08/10 (月) 14:19:03 - ばくてりあ あれから、特許の書類（patent application publication: Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples）を読んでみました。 ちゃんとした論文ではないせいか、あまり詳しくは書いてなかったのですが、信用していいものなのでしょうか。 投稿論文に特許の書類をリファレンスとして載せるわけにもいかないでしょうし… この組成でRNAを保存して実験している論文って、出ているのでしょうか？どなたかご存知でしたら、お教え下さいm(_ _)m ＞APさん ある程度薄めて使うのもよさそうですね。 ただ、そうなると、大量に使うことになるので、やはり自作が必要か… ＞おおさん 粉をぶち込むのも考えたのですが、混ぜて溶かす間に湖水中の環境が劇的に変わりそうな気が… 湖水自体をRNA精製用D solにするというのはよさそうですね。 ところで、Dsolとはなんでしょうか？毒性のあるものだとしたら、作業が大変な気がします。 最近、水中のRNAを取るために、微生物をトラップしたフィルターをRNAlaterにつけて、mRNAを解析した論文が出ていました。 http://pt.wkhealth.com/pt/re/envm/abstract.00125945-200905000-00023.htm;jsessionid=K1nVL2LZhQj3nw6RF7QHLzWxzxy6FxzR9k7LhpVYgwhFFKKNQSG4!-1104825961!181195629!8091!-1 ただ、やはり個人的には、フィルターにトラップする前に固定したいな、と考えてます。 ＞pumpkinさん 多少の変化はしかたがないかとは思うのですが、できるだけ抑えたいな、と考えてるところです。 ただ、研究例があまり見当たらないところをみると、難しいのかもしれません… 廃液に関しては、毒性のあるものではなさそうなので、あまり心配はしていません。 フィルタリングは、いつも注射筒で手でやってます。 具体的に考えを進めていくと、まだまだ問題点が出てきそうですが… ＞amiさん 硫酸アンモニウムの粉を大量に入れているので、容量が１Lよりも大きくなりそうですね。pH調整もするし。ところで、pH調整する前のpHは、5.2よりもだいぶ高かったですか？ 上手くいくかの検討は、コントロールを設けて予めしなければいけないのでしょうけど、RNAlaterの力を信じて、今回は検討しないでいこうかな、と考えてます。 無事RNAがとれるとよいのですが… ＞ザンギさん たしかに、バクテリアの場合、浸透圧調整の機構が働きそうですね。 たしかに、大腸菌やバチルスなんかでは上手くいっているみたいですが、実際のところ、どうなんでしょうね… 今回対象としているmRNAが、浸透圧機構に関係のない遺伝子なので、とりあえずはいいかな、と思ってます。 上で紹介した論文では、mRNAを対象に、上手くやっているみたいなので、少し期待が持ててきました。

(無題) 削除/引用 No.998-7 - 2009/08/07 (金) 12:40:46 - ザンギ RNAlaterってバクテリアに有効なんでしょうか？ 菌体を破壊するわけではないでしょうし、菌が生きてれば浸透圧ストレス でOmp系が動きそうですし。 高濃度硫安で受容体が変性しちゃうのでしょうか（笑） 調べてみたらメーカーはこんなこと言ってますが．．． http://www.ambion.com/techlib/tn/95/9510.html ribosomalRNAの分解抑制には効くみたいですが、mRNAにも有効って信じて いいのか．．． 発現レベルが高い遺伝子を対象にして、菌叢の構成を調べる。というような 目的ならいけるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.998-6 - 2009/08/07 (金) 11:39:49 - ami うまくいくかめっちゃ興味あるので情報提供しました、続報お願いします。

(無題) 削除/引用 No.998-5 - 2009/08/07 (金) 11:38:07 - ami http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/RNAlater.html RNAlaterの作り方らしぃですけど、作ってみたら、たぶん1L作るレシピだと思ったのですが、1L以上できて、薄くなったので、水の量は考えた方がいいと思いました。

(無題) 削除/引用 No.998-4 - 2009/08/07 (金) 11:15:52 - Pumpkin 湖水からRNA抽出という非常に特殊なケースで、非常に興味がありますが、 >フィルターに水中のバクテリアをトラップしている間にもRNAが分解されてたり、新しいRNAが生成されてしまうのではないかという心配 これはいたしかたないことではないでしょうか。フィールドで行われる採取をより迅速にということであれば、隣接するようにラボを立てて、すぐに抽出できるようにする、みたいなことができれば一番ですけどね。 湖岸で湖水をフィルタートラップして、それを持参したRNAlaterに漬けて、ラボに帰るというのがいいんじゃないですか？アスピレーターは車のバッテリから取ればいいでしょう。確かにRNAlaterは自作できますが、大量の廃液とか遠心操作によるロストか、それ以上の心配事もわっさわさと出てきそうです。 どうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.998-3 - 2009/08/07 (金) 10:18:19 - おお RNAlaterと同じ成分になるように、試薬(粉末)をぶち込むか、、、 GuCNとか加えて湖水自体をRNA精製用D solにしてしまう。 と言うようなことを考えているのですが、、、、 そんなにスケールが大きくなって(収量はそんなにないだろうとおもうので) 精製とかうまく行くのでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.998-2 - 2009/08/06 (木) 14:53:39 - AP RNAlaterのinstructionには詳しく書いていませんが、RNA精製用に全血や血漿のサンプルに適用する方法がRiboPure Blood Kitの説明書にあります。それによると、0.3-0.5 mLの全血にたいして1.3 mLのRNAlaterを加えるようです。500 mLに対してだと1.3 L。現実的ではないですね。 以前のトピックスで、RNAlaterの成分についてや、相当品を自作の話があったと思います。それでなんとかならないか、、

RANlaterによる湖水中のRNA保存について 削除/引用 No.998-1 - 2009/08/06 (木) 14:00:30 - ばくてりあ 環境中の微生物の生態の研究を行っているものです。 私は、湖水中のバクテリアの生態を研究する時、500mlくらいの湖水をフィルターにかけ、バクテリアをトラップしたフィルターから直接、DNAやRNAを抽出し、抽出したDNAを基にしたPCRにより目的の遺伝子を増幅して、バクテリアの群集構造を調べる、という作業を行っています。 DNAは、フィルターにトラップしてすぐに冷凍保存しているのですが、 RNAはDNAに比べ、より低温下で保存しなければ分解が進んでしまうため、身近に-80℃以下の冷凍手段がない場合、トラップしたフィルターをRNAlaterにつけて冷蔵保存する、という処置をしています。 しかし、フィルターに水中のバクテリアをトラップしている間にもRNAが分解されてたり、新しいRNAが生成されてしまうのではないかという心配をしております。 そこで、採取した湖水に直接RNAlaterを入れることでRNase活性を止めることができないかと考えています。 しかし、プロトコルにはRNAlaterを原液で使用することしか書いていません（動物細胞のRNA保存のための試薬なので仕方がないとは思いますが…）。500mlの湖水に大量のRNAlaterを投入するのは非現実的だと考えています。 そこで、皆さんにお聞きしたいのですが、 RNAlaterはどのくらいの希釈倍率まで使用可能なのでしょうか？ 文章が長くなってしまいましたが、ご指導のほど、よろしくお願いいたします。

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