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(無題) 削除/引用 No.993-6 - 2009/08/08 (土) 03:25:35 - c ご存知のようにprotein A やGはIgGに非常に強く結合しますが、 未変性のアルブミンと弱く結合性する部位も持っているそうです。よって分子量や含量から考えておそらく高分子量のものはalbuminではないでしょうか。あとalbuminは還元非還元で移動度少し変わります。分子量は70KDaくらいですが量多いと65-90KDaくらいに結構ブロードにでたりします。私は自分でポリクロ抗体を作っていたときは、Protein Aカラムにいく前に硫安分画でまず粗グロブリン画分を得て、そのあと透析して硫安を除いたものをprotein Aカラムに掛けていました。硫安分画で除アルブミンがなされているせいかこうした問題は出会いませんでした。 IgGは還元時に（特に加熱処理が不十分だと）S-Sが完全に切れにくいときがあって、L+Hで70-90KDaくらいにシグナルが出る事がありますが、溶出画分が異なるという事なのでこれが原因ではないと思います。 いずれにせよ泳動パタンよりも、抗体活性を示す画分を見つけて回収することが一番重要とおもいます。

(無題) 削除/引用 No.993-5 - 2009/08/07 (金) 10:15:24 - qq HRP標識の抗ウサギIgG（H＋L）を持っているでしょうから（？）、ウェスタンで調べればはっきりするのではないでしょうか？ ところで、Protein AセファロースでIgGを精製するのは、モノクローナル抗体なら効果的かと思いますが、ウサギの抗血清では、それほど大きなメリットを感じることができません。結局、ピュアな（特異＋非特異）抗体を得てしまうからです。 実験目的に依るのかもしれませんが、ウサギのIgGを精製するだけなら、硫安分画程度でよろしいのではないでしょうか？ また、特異抗体を精製したければ、抗原を固定化したカラムを使う方がよろしいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.993-4 - 2009/08/06 (木) 21:35:41 - ヤナギ ＞糖鎖修飾の相違でしょう。 そんなことないですよ。そこまで大きな変化をさせる糖鎖修飾は、ウサギのIgG重鎖は受けないはずです。むしろ、2MEが古くて還元しきれてなくて、H鎖とL鎖がS-Sでつながったのがみえてるんじゃないですか？２つのフラクションという意味がよくわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.993-3 - 2009/08/06 (木) 18:20:38 - ats 糖鎖修飾の相違でしょう。

ウサギの血清からの抗体精製 削除/引用 No.993-2 - 2009/08/06 (木) 18:06:49 - ウナギ ウサギに抗原を免疫して、血清から抗体精製をするのでしたら、下記のサイトが参考になります。 http://www.gelifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/tips63.asp nativeの抗体を精製するのでしょうか？

ウサギの血清からのポリクローナル抗体精製 削除/引用 No.993-1 - 2009/08/05 (水) 12:30:18 - うさぎ 最近、初めてウサギの血清からのポリクローナル抗体の精製を行いました。 Protein Aを使い精製し、溶出のフラクションを2ME(＋）の状態でSDS-PAGEにておよびCBB染色しました。 その結果、2つのタイプのフラクションがとれていて、 一つは、80-90ｋDaのバンドと25Kdaのバンドが出るフラクション、 もう一つは、50kDaのバンドと25kDaのバンドが出るフラクションでした。 分子量の大きいバンドが出るフラクションの方が圧倒的にタンパク質量が多いのですが、ウサギの重鎖は50Kdaですよね？ 回収するのは、50kDaのバンドが出るフラクションかと思ったのですが、 それでいいのでしょうか？ また、80-90kDaのかなり濃いバンドは何なのでしょうか？ そちらの方にも25kDaの軽鎖と思われるバンドが出ているので気になります。 よろしくお願いします。

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