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(無題) 削除/引用 No.99-7 - 2009/02/28 (土) 11:36:33 - IRES >[Re:6] CJさんは書きました : > たとえばHRPやAPで標識した後、IHCの場合は色素発色法が感度が高い、とされていますが、ふつうWBでは発光法を使って検出しますよね。DABやNBT/BCIPを使っても検出できるが、感度は低い、といわれています。つまりWBではとても感度の高い方法を使って検出しているので、変性IgGに反応しうる２次抗体の一部が観察できるのではないか、と思いました。 これは十分に考えられることですね。 前回のコメントを書きながら検出感度の違いが頭の片隅に浮かんでいました。 WB用の二次抗体には変性IgGを認識しないものや、Light chain特異的な二次抗体など様々なものが販売されています。若干値は張りますが、改めてWB用の二次抗体をそろえるのであれば、最初からこういったものを揃えるのが良いのではないかと思います。私はこれまでTrue Blotを使用していますが、Jacksonからlight chain特異的な二次抗体が比較的安価に販売されておりますので、これも目的によっては良いのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.99-6 - 2009/02/27 (金) 22:27:36 - CJ IRESさん。 興味深い情報、ありがとうございます。 WBとは結果が違う、とのご指摘。おそらくこれは検出感度の違いにあるのかもしれません。というのも抗体は似たようなものを使えるはずですから。 たとえばHRPやAPで標識した後、IHCの場合は色素発色法が感度が高い、とされていますが、ふつうWBでは発光法を使って検出しますよね。DABやNBT/BCIPを使っても検出できるが、感度は低い、といわれています。つまりWBではとても感度の高い方法を使って検出しているので、変性IgGに反応しうる２次抗体の一部が観察できるのではないか、と思いました。 WBには苦手意識があるので、このような情報はとても役に立ちます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.99-5 - 2009/02/27 (金) 10:16:49 - IRES >[Re:4] CJさんは書きました : > さて、多くの２次抗体は変性したIgGを認識しないようです。これはオートクレーブによる抗原賦活後、免疫組織化学を行うと内因性IgGによるアーチファクトが消失することからの推測です。Westernはあまり得意でないので参考意見程度に聞いていただきたいですが、サンプルの準備の際にSDSを加えてボイルすることを考えると、内因性IgGはだめになってしまっている、と考えるのが自然ではないでしょうか。レフェリーも文句言わないんじゃないですか。それにこれは１次抗体抜きのコントロールを取ることで簡単に確かめられます。 これは日常的にWBを行っているものとしては意外な情報ですね。むしろ私の経験ではほとんどの二次抗体は変性IgGも認識するという感じです。免疫組織染色に用いられる二次抗体は既に変性IgGを認識しないような操作が行われているのではないでしょうか？質問者さんへの対処法は前に述べたとおりです。一次抗体抜きのコントロールで様子を見るのは重要ですね。

(無題) 削除/引用 No.99-4 - 2009/02/27 (金) 00:07:57 - CJ 免疫組織化学の場合、内因性IgGが多い組織の場合はMOMを使わないとわけのわからんことになります。例えば脳の場合はあまり内因性IgGが多くないようで（血管周囲には多いようですが）問題にならないことが多いです。（ただし潅流固定の良し悪しによってこれは変わってくるように思えます） さて、多くの２次抗体は変性したIgGを認識しないようです。これはオートクレーブによる抗原賦活後、免疫組織化学を行うと内因性IgGによるアーチファクトが消失することからの推測です。Westernはあまり得意でないので参考意見程度に聞いていただきたいですが、サンプルの準備の際にSDSを加えてボイルすることを考えると、内因性IgGはだめになってしまっている、と考えるのが自然ではないでしょうか。レフェリーも文句言わないんじゃないですか。それにこれは１次抗体抜きのコントロールを取ることで簡単に確かめられます。

(無題) 削除/引用 No.99-3 - 2009/02/26 (木) 23:54:26 - lipid 免疫染色ではMOMなしでもうまくいくときもあり、気にしていませんでした。 Westernに関してもMOMのようなものがあるのですか？

(無題) 削除/引用 No.99-2 - 2009/02/26 (木) 07:31:28 - IRES 理論的にご指摘の問題はあります。対処しなくて上手くいく場合もありますが、refereeに指摘されたときのことを考えると対処した方がよいですよね。 直接標識抗体を使うとか変性IgGを認識しない二次抗体を使うとか。

MOM（マウス オン マウス）に関して 削除/引用 No.99-1 - 2009/02/26 (木) 04:34:38 - タンパック 疑問点としてはmouse組織に対するウエスタンブロットで二次抗体にanti mouse IgGを使っても問題ないのかな？ということです。理論的には一次抗体だけではなく内在性のmouse IgGバンドをも染めてしまいますよね？ ただ実際、気にせずに行ってうまくいったときもありました。 同様に免疫染色ではこのような場合、これを予防するMOM（mouse on mouse）というkitを使うことを推奨されていますが、これもうまくいかなかったらMOMを使うと考えていいのでしょうか？ ご教授ください。

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