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(無題) 削除/引用 No.987-12 - 2009/08/08 (土) 09:52:40 - 生化研 APさん、CJさん、taniさん　ありがとうございます。 今回ABCを新しくしてみたとこきちんと染色されました。 過酸化水素は以前のものと新しいものを比べてみましたが、あまり差はないみたいです。 ただ、以前のABCが残ってないのでABCのみが原因で反応が起こっていなかったかは確定できませんでした。 今後実験を進めていき、原因が分かり次第報告したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.987-11 - 2009/08/07 (金) 22:00:23 - CJ taniさん このばあい、問題は過酸化水素にありそうなのですから、買い替えを薦めるのはまだ早いような気がします。おまけにもし過酸化水素がだめだったら他のキットを使っても結局だめですよね。

(無題) 削除/引用 No.987-10 - 2009/08/07 (金) 11:41:04 - tani 生化研さん いっその事、二次抗体、ABCを別のメーカーに変えてみては如何ですか。 ボクもABC法はダメではないのですが、シグナルが弱い感じがしていたので、新しい実験を始 めたのをきっかけに、長年使っていた、ABCの二次抗体、DABをニチレイのヒストファイン、シンプルステインMAX-PO、シンプルステインDAB溶液に変えてみました。 簡単だし、再現性もいいで感心しました。まあ、一つのメーカーにこだわらないのも大事です。 もしそれでもやはりだめなら、問題は免疫染色以前にあるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.987-9 - 2009/08/06 (木) 23:36:03 - AP 6月に開封した過酸化水素水なのに、 >過酸化水素は私も疑っていて、出なくなってから一度、七月に過酸化水素の濃度を振って出る条件を確立しました。 7月にはすでにそういう状態であったとすれば、異常な速さで過酸化水素が分解していることに他ならないのではないでしょうか。その時点で分解を促進する要因を排除する処理を施したわけではないでしょうから、それからもさらに分解が進んで、 >しかし、一度出るようになったにもかかわらず、また出なくなったのです。 ということが起こるのではないでしょうか。 たとえば、鉄や銅、あるいはCoやMnのような遷移金属がコンタミしたとか、微生物由来のカタラーゼがコンタミしたとかで、分解が促進される可能性はあります。

(無題) 削除/引用 No.987-8 - 2009/08/06 (木) 21:37:48 - CJ 過酸化水素はきちんとふたをしていれば1年以上持ちますね。 「1度出るようになったが、すぐにだめになった」というのがなにやら怪しいです。その試薬は共用していますか？もしそうならひどい手技の人がコンタミを広めているとか…。（経験あり：ＡＢＣをコンタミされて実験がおじゃんになったことがあります）

(無題) 削除/引用 No.987-7 - 2009/08/06 (木) 20:06:48 - 生化研 APさん、CJさんありがとうございます。 過酸化水素は私も疑っていて、出なくなってから一度、七月に過酸化水素の濃度を振って出る条件を確立しました。 しかし、一度出るようになったにもかかわらず、また出なくなったのです。 過酸化水素は今年の6月にあけたとこですがどれくらいでダメになるのでしょうか？ 何度も申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.987-6 - 2009/08/06 (木) 08:04:59 - AP >過酸化水素の濃度を一桁から二桁くらい高く加えてみてはどうでしょう。 と書きましたが、これは過酸化水素がへたっているときでも私はこうして染色してしまうことがありますということです。もちろん未開封のを使えるなら、そのほうが再現性の上でも好ましいでしょう。 まず、チューブ内でH2O2量を通常濃度から100倍くらいまで振った発色液を少量のPO標識ABCで反応させて、試してみるといいと思います。

(無題) 削除/引用 No.987-5 - 2009/08/06 (木) 01:44:10 - CJ ＡＰさんの過酸化水素がへたる説に一票。 なお、ＤＡＢ反応を20分以上やっても後はバックグラウンドが上がるだけで意味はありません。

(無題) 削除/引用 No.987-4 - 2009/08/05 (水) 22:08:24 - AP 試薬を刷新してみてもだめとのことですが、基質液もですか（ABCキットには調製済みのがついてくるんでしたっけ、自前で作るんでしたっけ？）。ひょっとすると、過酸化水素がへたっているのかも。希釈して保存していると分解しやすいし、原液でもコンタミなどによって分解が進んでいる可能性があります。過酸化水素の濃度を一桁から二桁くらい高く加えてみてはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.987-3 - 2009/08/05 (水) 21:35:50 - 生化研 CJさん、回答ありがとうございます。 試薬は免染を行う時に調整するのでコンタミはしてないと思います。 以前はDAB液につけて5分もたたずに脳切片が茶色く色づいてましたが、最近は色が付くまでに40分以上かかることや、 染まっていてもとても薄く、顕微鏡でも陽性核細胞があまり染まっていないのが現状です。 同じプロトコールでも染まる時はデータになるのですが、染まらない時では結果になりません。 酵素抗体法を行う上で注意点などがあれば教えてください。 何度もすいませんがよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.987-2 - 2009/08/05 (水) 01:31:00 - CJ DAB反応は温度依存性です。私のいた研究室は冬の暖房が貧弱だったため、冬は発色時間が明らかに長く必要でした…。 しかしながら、温度が低いから染まらん、ということはありません。 どういうタイミングで発色を停止していますか？私は必ず発色を実体顕微鏡ないし普通の顕微鏡で確認して、十分な染色が得られてから反応を停止しています。十分な数のc-fos陽性細胞がいれば、実体顕微鏡下で問題なく確認できます。 他の可能性もあるんではないかと怪しんでいます。例えばアザイドのコンタミなど…

凍結切片の酵素抗体法 削除/引用 No.987-1 - 2009/08/04 (火) 22:38:33 - 生化研 いつもここを参考にさせていただいていて非常に勉強になります。 脳組織を還流固定後、凍結切片(３０μ)を作成しfree-floating法でc-Fosの染色を行っているのですが、最近染まりが悪く、データが出ません。 １次抗体はサンタクルズの１万倍希釈を用い、vector ABCで増感した後DABで染色しています。 夏前に行っていたプロトコールでは染色はされていたのですが、夏以降同じプロトコールで染色しても、脳切片がほとんど染色されなくなりました。 １次抗体、二次抗体、ABCを新しくしても染色されません。 考えられるのはクーラーの風があたってDAB液の温度が低下している可能性も考えられるのですが、少々温度が低下したぐらいでDAB反応はしなくなるのですか？ まだまだ免疫染色を始めて日が浅いのでわかりません。どうか詳しい方アドバイスをいただけないでしょうか。 よろしくお願いします。

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