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(無題) 削除/引用 No.979-10 - 2009/08/07 (金) 10:36:07 - ^^ 他トピで叩かれている件についても ちゃんと答えてくださいね^^

(無題) 削除/引用 No.979-9 - 2009/08/07 (金) 10:24:46 - 麻酔薬 JJさん　本当に貴重な知識をありがとうございました。 まさに私はアセトン固定ですので、この方法で再チャレンジしてみます。 CJさんoguさんsyaberoさんもありがとうございました。APさんも 分かりにくい言葉に柔軟に対応していただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.979-8 - 2009/08/05 (水) 22:23:48 - JJ Alexa標識抗体反応後、3回Washして、10%中性緩衝ホルマリンか4%PFAで10〜20分固定し、また3回Washした後DAPIやHoechstなどで核を染色します。後固定によって観察中に形態が崩れていくのを防ぐことが出来ます。

(無題) 削除/引用 No.979-7 - 2009/08/05 (水) 14:13:15 - 麻酔薬 皆様　ありがとうございます。 貴重なお話が聞けて大変たすかりました。 膜を剥ぐことや、未固定でスクロース処理が出来ないことなどは 知らないことでしたので、為になりました。 確かに非固定凍結切片というのは、蛍光抗体法に有効というだけであって、 無効であるわけではないのですよね。 勉強足らずでお恥ずかしい限りでした。 JJさんのおっしゃる「Alexa色素であれば2次抗体反応後にフォルマリンで後固定すると改善します』 というのをもう少し詳しくお聞きしたいです。 ホルマリンの濃度やその後の処理なんかを聞かせていただけないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.979-6 - 2009/08/05 (水) 05:17:34 - JJ 臓器にもよりますが、無固定凍結標本からでも十分にきれいな切片を作成することが可能です。臓器についている水分をなるべく除き、OCTの中で共洗いしてなじませてから、冷却剤などを用いて素早く凍結させるのがポイントです。無固定を薦めるのは抗体のよって相性の良い固定法が違うからです。私の経験ではメタノール固定がもっとも多くの抗体に対応しており、PFAで染まる抗体でも、メタノール固定にするとさらに強いシグナルが得られることがあります。中にはアセトンでしか染まらない抗体もありますがそれほど多くはありません。メタノールやアセトンなどの弱い固定では形態が崩れてしまうことがありますが、Alexa色素であれば2次抗体反応後にフォルマリンで後固定すると改善します。

(無題) 削除/引用 No.979-5 - 2009/08/04 (火) 21:44:21 - CJ 未固定でスクロース置換はできません。細胞が収縮してひどい結果になりますよ。 固定によって抗体の浸透が悪くなるのは事実ですが、圧倒的大多数の人はそれでも固定した組織を使用します。固定をしないと組織像がひどくなるし、結果もばらつきがちです。 「膜をはぐ、はがない」ということについて。 ＯＣＴを使うときのポイントとして、組織とＯＣＴを良くなじませる、ということがあります。膜があると組織とＯＣＴがなじまないのでうまく切片が切れなくなるのです。 なお私は３０％スクロースを使っていますが、overnight固定した組織を直接スクロースに放り込んでいます。これでまったく問題ありません。

(無題) 削除/引用 No.979-4 - 2009/08/04 (火) 21:43:29 - ogu どの論文を見ても基本プロトコールは「固定組織切片」でしょう。 ＞聞いたことがあり・・・・ 現状では固定すると染まらないのですか？ また、その抗体を使った他の論文はどうでしょうか。 組織像（切れ味）が悪いのと、染まらないのは別問題として考えるべきだと思いますが、いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.979-3 - 2009/08/04 (火) 18:54:58 - syabero わたしも現在、組織の免疫組織染色を行っていますが、PFA固定した後、sucrose置換してもとくに染色ができていない、などの問題を感じたことはないですよ。 0.9% salineで灌流後、すぐに4% PFAを流して固定した後、さらに4% PFAに一晩漬けてしっかり固定し、10% sucrose→20% sucrose→30% sucroseと順次置換し、-30℃(できれば-80℃)で凍結保存して、時間のあるときに切片を切っています。sucrose置換するとべたべたして切りにくいので、compoundに埋めて切っています。 この前、組織を30% sucrose置換した後に膜を剥いてから凍結保存したのですが、膜を剥いた組織の方が格段に切片が切りやすかったので、膜を剥くことで形がくずれやすい、など問題の生じない組織でしたら膜を剥くことをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.979-2 - 2009/08/04 (火) 12:50:09 - AP 蛍光抗体が「入りにくい」とはどういうことですか？　浸透しにくいということ？　単にそまりが悪いと言うこと？　あんまり変な業界用語や慣用表現、内輪の隠語は使わないで、正確な描写を心がけた方がいいです。学術的な場であるからというだけではなく、なにを言おうとしているのか、他の人に伝わらないので自分が損をします。 蛍光抗体だからという、特別なことはあんまりなくて（あるとしても現段階で考えなくてもいいでしょう）、抗体染色、抗体反応が可能かどうかが問題ではないですか。それとも、蛍光抗体でない抗体ならば動いている系なんでしょうか。 固定によって抗原性が損なわれることはありますが、それは蛍光抗体だろうと無標識抗体だろうと同じだろ、と思うのです。多くの場合、固定法を工夫したり、抗原の賦活化処理を工夫したり、あるいは同じ抗原に対する別の抗体をに変えたりして解決を計ります。

凍結切片で蛍光抗体染色 削除/引用 No.979-1 - 2009/08/04 (火) 11:55:50 - 麻酔薬 凍結切片を作成し、蛍光抗体を使いたいのですが、 組織を切り出すときに、PFA固定を行うと蛍光抗体が入りにくいと 聞いたことがあり、現在は無処理のままPBSで軽く血液などを洗い流し、 そのままOCTコンパウンドで包埋している状態です。 ですが、やはり組織がスダレ状になったりとOCTとの差もあり 本当にきれいな切片というわけにはいかないのです。 スクロースに浸けてからOCTコンパウンドに、という方法を取り入れてみようとおもうのですが 蛍光抗体の入り方に影響はあるのでしょうか。多少の程度であればよいのですが。 実際PFA固定の場合の蛍光の入りも単にこちらの手技がいまいちだったのかもしれません。 実際のところをおしえていただきたいのです。 スクロースだけの処理でも違いはでますでしょうか。 今のところ２０%のスクロースに一晩浸けてOCTコンパウンドで包埋してみようと 考えております。スクロースの希釈を段階的に行う方が丁寧でしょうが、 できれば処理は極力抑えたく思っております。 よろしくおねがいいたします。

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