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発現大腸菌のグリセロールストック 削除/引用 No.975-9 - 2009/08/09 (日) 19:15:33 - apes Aさん 貴重な情報ありがとうございました。 発現タンパク質が必要になった時、その都度トランスフォーメーションする場合、コロニーの選別はどのようにしていますか。 1.　挿入配列の確認は行わず1クローンから定法に従って発現誘導する 2.　数クローンを拾って混合・希釈・培養して発現誘導する 3.　コロニーPCR、あるいはプラスミドを抽出して制限酵素処理などで確認し、確認できた物を誘導に用いる どの程度エラーが出るのかは大腸菌などの条件によっても変わるかも知れませんが、ご教授の程どうぞよろしくお願いいたします。

発現大腸菌のグリセロールストック 削除/引用 No.975-8 - 2009/08/07 (金) 18:51:56 - apes Aさん 貴重な情報ありがとうございました。 発現タンパク質が必要になった時、その都度トランスフォーメーションする場合、コロニーの選別はどのようにしていますか。 1.　挿入配列の確認は行わず1クローンから定法に従って発現誘導する 2.　数クローンを拾って混合・希釈・培養して発現誘導する 3.　コロニーPCR、あるいはプラスミドを抽出して制限酵素処理などで確認し、確認できた物を誘導に用いる どの程度エラーが出るのかは大腸菌などの条件によっても変わるかも知れませんが、ご教授の程どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.975-7 - 2009/08/04 (火) 23:01:52 - A 私の研究室でもっとも頻繁に蛋白質発現に使っているグリセロール ストックはグリとグラさんが使われている方法で行っています。 PCRチューブに大量に注中したグリセロールストックをディープ フリーザーに保存して使いきりで3年ほど使っていますが、今のところ 発現に問題があったことはありません。

発現大腸菌のグリセロールストック 削除/引用 No.975-6 - 2009/08/04 (火) 19:56:55 - apes 皆様、貴重な意見をありがとうございます。 やはりグリセロールストックからの継続利用は控えた方が良いようですね。 確かにグリセロールストックはディープフリーザーを圧迫していますので、逐一トランスフォーメーションの方が良いのですが、手軽さを比較するとなんとかならんもんかと思ってしまいます。分注しておいておくのも良い方法ですね。PCRチューブなどに入れておけば、そんなに保存場所を圧迫しないかもしれません。まねしてみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.975-5 - 2009/08/04 (火) 17:29:41 - グリとグラ グリセロールストックから起こし直すと発現が低下することがよくあるというのは経験しています。 でも、ラボ中でやってるキナーゼアッセイの基質タンパク質みたいに、ルーチンで頻繁に発現させなきゃいけないような場合には、いちいち形質転換するのもたいへんですよね。 私たちのところでは、きちんと発現が確認できた（後になって分かるのですが）フレッシュカルチャーをグリセロールストックの形で沢山のチューブに分注しておき、ディープフリーザーの一番奥に仕舞っておいてます。発現させるときにはそこからチューブ一本丸ごとを培地に植菌し、いつも決まった時間培養して誘導を掛けるようにしてほぼ問題ありません。シングルクローンを取るわけではないので、駄目になるといってもチューブ一本丸ごとが急に悪くなるわけではないと思ってそうしているのですが、実際に発現が悪くなるのもある時点を境にという感じなので、そうなったら残りを捨てて次のストックを作っています。

(無題) 削除/引用 No.975-4 - 2009/08/04 (火) 07:50:46 - aimar 理由はわからないのですが、確かにグリセロールストックすると発現量が減りますね。 なので、ストックはせずに、必要になればその都度トランスフォーメーションするようにしています。

(無題) 削除/引用 No.975-3 - 2009/08/04 (火) 06:26:38 - 巣解く タンパク質発現用の大腸菌において、私自身、又ラボメイトもグリセロールストックからの使用で発現が弱くなった、無くなったという経験がありました。それ以来、逐一トラフォメからやり直しています。 cDNAやらの増幅のための大腸菌も最近ではグリセロールストックを作るのを止めました。何十、もしくはそれ以上のベクターを構築していくと正直フリーザー類のスペースがなくなってくるもので、、、

(無題) 削除/引用 No.975-2 - 2009/08/04 (火) 05:10:43 - おお グリセロールストックはリスクがあると思っています。 毎回ベクターのトランスフェクションか、ストックの場合は 線画培養で数クローン拾うようにしています。

発現大腸菌のグリセロールストック 削除/引用 No.975-1 - 2009/08/03 (月) 21:14:22 - apes 大腸菌を用いたタンパク質発現についてご教授ください 発現用大腸菌株（BL21株など）に構築した発現ベクターを導入したものから、グリセロールストックを作成して、継続して実験に用いるのはリスクがあるでしょうか。皆さんはどのように組換えタンパク質を作成しているのでしょうか。 1.組換えタンパク質が必要になったときに、その都度、発現プラスミドベクターを発現用大腸菌株に形質転換して、発現させ、精製する。 2.発現ベクターを導入した発現用大腸菌のグリセロールストックから培養、発現、精製を行う。 使用しようと思っているのはK12株由来のendA+、recA+、ompT-の少し使いにくい株なので、どうしたものかと悩んでいます。 基本的なご質問かもしれませんが、どうぞよろしくお願いいたします。

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