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やったことがないので… 削除/引用 No.973-18 - 2009/08/24 (月) 16:49:25 - mom-a 当てにならない意見かもしれませんが >今回、実験で使うトランスウェルとは別のトランスウェルに、 >実験と同じ条件で播種したものを培養し、内皮細胞に >蛍光色素を内皮に取り込ませて蛍光顕微鏡で観察しようと考えたのですが、 >正立蛍光顕微鏡しかないため、ウェルの状態で観察できません。 どうせそのウェルは使わないのでしたら、ギムザ染色とかして観察できないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.973-17 - 2009/08/19 (水) 18:43:54 - とまと ご回答ありがとうございます。 自然落下といった表現は誤解を招いてしまったようです。 申し訳ありませんでした。 mom-aさんがURLを示していただいたような実験系を行おうと思っています。 TNFαについてですが、他の実験でも同じTNFαを用いて結果がきちんとでているので、TNFαの活性については問題ないと考えられます。 ポアサイズについては、もう少しポアの大きいトランスウェルを 用いて再度検討してみようと思います。 ちなみに、トランスウェル（ポリカーボネート製）で コンフルエントを確認する時、みなさんはどのような方法で 確認されているのでしょうか。 今回、実験で使うトランスウェルとは別のトランスウェルに、 実験と同じ条件で播種したものを培養し、内皮細胞に 蛍光色素を内皮に取り込ませて蛍光顕微鏡で観察しようと考えたのですが、 正立蛍光顕微鏡しかないため、ウェルの状態で観察できません。 また、通常のマルチウェルプレートに同じ細胞数だけまいて、 倒立顕微鏡で観察することも考えたのですが、 メンブランとプレートでは発育条件が異なるために、 比較してよいのかどうか困っています。

論文になっているなら 削除/引用 No.973-16 - 2009/08/19 (水) 13:15:47 - mom-a 早く示された方が有益なレスがつきますよ。 chemotaxisではない、ということをおっしゃりたかったのでしょうが「自然落下」という言葉は混乱を招く原因になってしまったと思います。 論文を出せといっておきながら、じっくり読んでいる時間がちょっとないし、専門外だし…などというと怒られそうですが（汗）おやりになりたいのは↓のようなシステムですよね？（遊走細胞の測定法とか違っていますが。） http://www.cosmobio.co.jp/product/raku/00790012.asp 内皮の間隙を通り抜けるのも、やはり「重力に従った自然落下」ではありません。接着因子などが関連します。ということで、この系の場合、むしろ内皮抜きのただのメンブランでは遊走しないのではないか、と私は想像するのですが。内皮細胞間を通り抜けるという運動をしている細胞（活性化？）でないとポアを通り抜けないのでは…。（提示できる根拠データなし状態なので、無条件に信用しないように。） で、質問の内容に戻りますとNo.973-2の月詠さんのアドバイスをまず検討してみるのが良いと思います。 >サイトカインはTNFαを用いていますが、TNFαは内皮に投与するので、今回の原因とはあまり関係がないように感じられます。 内皮がTNFαに反応しなかったら、遊走しないと思います。ですから、内皮細胞の状態、TNFαの活性、ともに重要でしょう。 ポアサイズについても、培養条件などで細胞の大きさが違ってくることもよくあります。chemotaxis assayではありますが、ポアサイズを変えて劇的に改善したのを目にしたことがありますので、検討する価値はあると思います。（ただし、先に述べたように内皮細胞抜きでは遊走しないんじゃないかと思います。）

(無題) 削除/引用 No.973-15 - 2009/08/19 (水) 12:13:01 - とまと コメントありがとうございます。 参考文献を紹介致します。 �@「Roles of Glycosphingolipids in Cell Signaling:Adhesion,Migration,and Proliferation」 By SUBROTO CHATTERJEE and HEMING WEI METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.363 �A「Identification of a novel transcript of human PECAM-1 and its role in the transendothelial migration of monocytes and Ca+2 mobilization」 Biochemical and Biophysical Research Communications 320(2004)1228-1235 �Aを読んでいたところ、詳細が記載してある参考文献として�@があげられていました。 細胞のカウントは、下室のMediumを回収後、トリパンブルー染色し、血球計測版にて計測します。

(無題) 削除/引用 No.973-14 - 2009/08/19 (水) 11:51:31 - uu 横から質問ですみません。 遊走した細胞を数えるのはどの方法が一般的なのでしょうか？ 何かで染めて目視で数えるのですか？それとも吸光度を測定するのですか？ 興味があったので質問してみました。

(無題) 削除/引用 No.973-13 - 2009/08/18 (火) 20:32:39 - mom-a >自然落下で内皮の下にあるポアを単球が通って下に行くことが遊走とはいえないのでしょうか・・ 10-20μmの細胞が細胞自身よりも小さい3-5μmの穴を「自然落下」すると思いますか？スカスカのところをストンと落ちるのではなく、小さな穴に潜り込んでいかなければ通り抜けられないと思うのですが、どうでしょう？このメソッドでやっているというグループは「自然落下」という表現を使っていますか？論文になっていれば紹介していただけると助かります。 さて、ボイデン・チャンバー法で、走化因子の濃度勾配をつけないで実験したことはあります。ただし、それは化学物質をチャンバーの下室のみ、上下室両方に入れて実験し、前者と後者で差がなければ走化性ではなく、「細胞の運動性の亢進」によって膜を通り抜ける細胞が増えた可能性があるのでは、というものでした。 また、一般的な遊走試験でも同様だと思いますが、下室に落下した細胞を数える場合もありますが、膜の裏側にくっついている細胞を染色して数える、という方法の方が昔は多かったと記憶しています。 細胞はそんなにストン、ストン落下するものではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.973-12 - 2009/08/18 (火) 09:26:04 - とまと みなさんご回答ありがとうございます。 今回の実験では、単球の遊走をみたいのであり、 透過性の亢進をみたいわけではありません。 自然落下で内皮の下にあるポアを 単球が通って下に行くことが遊走とはいえないのでしょうか・・ もう少し考えて見ます。

(無題) 削除/引用 No.973-11 - 2009/08/06 (木) 04:17:55 - Kazu 細胞やプレートに問題ないとしましょう。 内皮がない状態で単球が移ってほしいわけですよね。 ポアサイズを大きくすれば落ちやすくなるのは当然と思いますが、予備実験で3,5,8のメンブレンを試されましたか。他人の論文を鵜呑みにして3マイクロしか試さないのであれば、かえってポジコンがとれるまでに時間がかかることもありますよと皆さん心配しておられます。 それでも重力で下に落ちてほしいのなら、遠心してGを上乗せする荒技もありますよ（自分ではやったことはないですが、ウイルスベクターの感染効率をあげたいときに遠心している人をみかけたことはあります）。

(無題) 削除/引用 No.973-10 - 2009/08/06 (木) 02:46:14 - DC 私もみなさんと同様に、とまとさんがなさっている実験系でなぜU９３７の遊走が起こるのかわかりません（実験系がきちんと動いているというのが前提ですが）。私の勉強不足でそのような実験系を知らないだけかもしれませんが・・・ それはともかくとして、まず実験系が動いているかのチェックが必要じゃないかと思います。 ・TNFが失活していないか ・内皮細胞がTNFの刺激を受けてレスポンスしているか ・用いているU937に遊走活性があるか など、サイトカイン・細胞側のファクターを細かく見てみるといいのでは？ ちなみに私はポアサイズ5 umのトランスウェルで遊走実験を行ったことがあります。その際の実験系では下のウェルにサイトカインを添加する事で遊走が観察されました。上のウェルに内皮細胞は入っていません。 サイトカイン添加しなかった細胞はほぼ遊走しませんでした。 遊走実験はかなり微妙な細胞活性を見ている部分もあるので、実験系が少し変わっただけで再現取れない場合が多いように感じています。培地を新たに作りなおしてみたり、細胞を起こし直してみたりする事で再現が取れた経験がありますので、試薬関係を調製し直してみてはいかがでしょうか。

http:// 削除/引用 No.973-9 - 2009/08/05 (水) 21:55:59 - TK-1 >[Re:7] とまとさんは書きました : > サイトカイン刺激によって、内皮の細胞間隙が変化するんです。 > それによって、単球は遊走します。 まず第一に、”実際に上記のようなメソッドで実験を行っているグループは あるので、遊走するとは思うのですが”という発想はどうなんでしょう。残念ですが、再現できないデータが乗っているペーパーはいっぱいあります。 ところで、その実験で何がみたいんですか？単球の遊走をみたいんですか、それとも透過性の更新がみたいんですか？それによって、対策が大きく変わると思いますが。

Re 削除/引用 No.973-7 - 2009/08/05 (水) 10:54:39 - とまと サイトカイン刺激によって、内皮の細胞間隙が変化するんです。 それによって、単球は遊走します。

(無題) 削除/引用 No.973-6 - 2009/08/05 (水) 09:39:59 - よっしー > 重力に従って落ちるだけです。 それを遊走と言うのでしょうか？ 単球が自然落下で内皮のモノレイヤーの下にある， 3マイクロの穴を通って下に行くとは考えにくいのですが， どういう状況になると下に落ちるとお考えですか？ 実験系がやはり良くわかりません． 内皮のジャンクションが開いたとかを見てるのかなぁ？ でもそんなのはTER測定したらすむ話だし・・・

Re 削除/引用 No.973-5 - 2009/08/05 (水) 09:10:50 - とまと 重力に従って落ちるだけです。 走化性因子などは何も入れません。 実際にそのような実験系で行っている実験はあり、 問題はないと考えられます。

(無題) 削除/引用 No.973-4 - 2009/08/04 (火) 18:34:03 - よっしー 単球は何に向かって遊走するとお考えですか？ 実験系が良くわからず，私の頭の中は？？？なのですが・・・

Re 削除/引用 No.973-3 - 2009/08/04 (火) 17:49:14 - とまと ご回答ありがとうございます。 単球はU937細胞を用いています。 サイトカインはTNFαを用いていますが、 TNFαは内皮に投与するので、今回の原因とはあまり関係がないように感じられます。 ポアサイズが小さすぎるというご指摘でしたが、 ポアサイズが３μmのトランスウェルで実験をやっている方がいるため、 私も3μmのポアサイズを使用しました。 実際、U937は細胞の大きさにばらつき（10-20μm)があるみたいなので、 ポアサイズを大きいものにするのも一つの手なのでしょうか。。 ポアサイズ３μmで全く遊走しないものが、5μmのポアサイズに変えたところで遊走するのかどうかも疑問です。 再びアドバイスよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.973-2 - 2009/08/04 (火) 02:24:34 - 月詠 単球やケモカインの種類に関する情報がありませんので一般論ですが、「内皮細胞層がない場合でも陽性反応がない」ということですので、実験系が適切に作用していないと思われます。 考えられる原因および検討項目としては、 （イ）ポアサイズが小さすぎる もっとも考えられる原因は、トランスウェルのポアサイズが不適切であることです。遊走試験用のトランスウェルは、３μｍ、５μｍ、８μｍの３種類のポアサイズのものが主に販売されているものと思います。 同じ血液細胞でも、小型のリンパ球や好中球は３μｍでも可能のようですが、大型の単球・マクロファージなどは５〜８μｍ細胞のポアサイズを選択された方がよいと思います。 （ロ）ケモカインの種類が細胞の種類に合ってない 用いている単球が、添加したケモカインに対する受容体を発現していないということはないでしょうか？ （ハ）細胞の生存率・応答性がよくない 細胞の生存率がよくなかったり、異物貪食能や刺激に対する活性酸素産生能、サイトカイン産生能などが正常か調べておいてはいかがでしょうか。 といったところでしょうか・・・。

遊走実験 削除/引用 No.973-1 - 2009/08/03 (月) 17:03:50 - とまと トランスウェルを用いた実験を考えています。 上室には内皮細胞を播種し、コンフルになった時点で サイトカインを投与。そして、単球を播種します。 インキュベート後、下室に遊走した単球をカウントします。 実際に何度かチャレンジしてみたのですが、単球は遊走しません。 内皮がない状態（メンブラン上）で、単球を播種してみても 遊走しませんでした。 トランスウェルはポリカーボネート製材。 ポアサイズは３μＭを用いています。 実際に上記のようなメソッドで実験を行っているグループは あるので、遊走するとは思うのですが、 どうして遊走しないのか原因がよく分からず困っています。 どなたか同じような実験を行っている方がいれば、 助言のほどよろしくお願いします。

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