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(無題) 削除/引用 No.972-9 - 2009/08/05 (水) 00:05:42 - orz まずストリップをぴったりとＳＤＳ面につけて 0.75%アガロースをとかして、流し込みます。 そのときに境界面に空気が入ってしまったら、 ストリップを極細ピンセット２本でストリップの上端を つまんでガスガスガスと上下に動かして空気を抜きます。 たとえ固まりかけていても空気は何とか抜けます。 それでも失敗してしまったら一度ストリップを抜いて、 アガロースをろ紙等で吸わせて素早く取り除き 何度でも再チャレンジをすればよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.972-8 - 2009/08/04 (火) 23:05:37 - おお >[Re:7] TSさんは書きました : > おおさま： > ラジカルでてるとまずいですかね？ > たしかに酸化損傷生成物ができる可能性がありそうですが。 それと、大量の酸化剤(APS)を使いながら、サンプルには還元罪(DTT/2-ME)を 入れると言う所に若干無理をかんじます。

(無題) 削除/引用 No.972-7 - 2009/08/04 (火) 22:52:00 - TS Pumpkinさま： 理解できました。 確かに、タンパクがゲルに移るまで固定されていれば良いわけですから、 そのような方法もありですよね。検討しています。ありがとうございました。 おおさま： ラジカルでてるとまずいですかね？ たしかに酸化損傷生成物ができる可能性がありそうですが。 それがどこまで問題となるかどうか。。。 というのを考えるよりも、避けといた方が良いというところですかね。 なるべく低濃度でやるのは手ですね、きっと。 それも検討してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.972-6 - 2009/08/04 (火) 10:03:18 - おお >[Re:1] TSさんは書きました : > ここで通常のResolving gelで固めるという方法は問題あるのでしょうか？ 重合のときにラジカルがバンバン飛んでいるイメージが あるんですよねぇ、、、 なるべく柔らかな0.4%とかぎりぎり固まるくらいのローメルティング アガロースだとやりやすいかもしれません。固めるのにコールドルーム とか持っていって固めてやれば何とか固まるでしょうし。。。。

(無題) 削除/引用 No.972-5 - 2009/08/04 (火) 09:51:08 - Pumpkin SDS平衡化済みのストリップゲルを、2次元展開用のSDS-PAGEにアプライします。このとき、既にランニングバッファは入れておいた方がいいです。入れておかないとゲルがガラス面にひっついてぐちゃぐちゃになることがあります。 ストリップゲルの位置を決めたら上から、専用のシャークティースコームを載せて、重さで固定するという方法です。ティースは13cmで3本くらいです。このときゲルが歪まないようにうまく乗せるのがコツですね。ですので、アガロースは一切使いませんし、だからといってうまく展開できないだとかそういう経験はありません。 日本エイドーのHPからカタログがDLできるので見てみてください。試してみようと思われたら、電話すると担当の方が来てくれると思います。だいたい、あの方しかこないと思いますがｗ

(無題) 削除/引用 No.972-4 - 2009/08/04 (火) 00:18:48 - TS Pumpkinさん： アイデアありがとうございます。 ただ、ちょっとよく分からないのですが、シャークティースコームを使うというのは、アガロースゲルを使わないと言うことなのでしょうか？ 少し詳しく教えてもらえますでしょうか？

お恥ずかしい 削除/引用 No.972-3 - 2009/08/03 (月) 17:47:22 - Pumpkin 櫛形コームという表現は間違っていますね。コームコームみたいな。シャークティースです。

(無題) 削除/引用 No.972-2 - 2009/08/03 (月) 17:44:32 - Pumpkin 確かにアガロースゲルでの封入は面倒で、失敗したときの虚しさは計り知れないですよね。 縦型電気泳動システムで二次元展開していれば、ストリップゲルを櫛形コームで浮かないようにして電気泳動すれば固定できます。私はそのようにやっていますが問題ありません。 ただし、シークエンスゲル用みたいなウェル間があまりにないものは通電がうまくいかないときもあるので、専用のものを購入すればよいでしょう。日本エイドーで4000円位です。ただ、それでもマーカー色素はコームに沿って歪んでくるのでサンプルがインゲルしたら取ってしまえば問題ありません。その後は熱や電荷で固着しますので大丈夫です。（これで、像が歪んだとかそういう経験はありません） Resolving gelで固めたという事例ではありませんが、参考になればと思います。

二次元目のアガロースゲルによるストリップの固定 削除/引用 No.972-1 - 2009/08/03 (月) 16:54:52 - TS いつも勉強させてもらっております。 初歩的な質問ですが、二次元電気泳動の二次元目のSDS-pageについてです。 教科書には、0.5-1.0%くらいのアガロースでIPGストリップを固定するように書いてありました。 やってみたところ、おそらく技量の問題だと思うのですが、固めるときに空気が抜けにくかったり、すぐに固まってしまったり、ということがありました。 ここで通常のResolving gelで固めるという方法は問題あるのでしょうか？ 粘性やゲル化する速度、慣れの問題で、こちらの方が簡単にできるような気がしてなりません。 どなたかご存じの方おりましたら、よろしくお願いします。

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