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ありがとうございます 削除/引用 No.970-33 - 2009/12/09 (水) 00:24:32 - みんみん あかね様 ありがとうございます。レスポンスが遅れて申し訳ありません。 早速明日の分生へ向かう電車の中で拝見させていただきます。 それと、ご報告が遅くなりましたが、教えていただいた論文を参考にさせていただいた結果、おかげさまでFISHのシグナルを得ることが出来るようになりました。 本当にどうもありがとうございました。 CJ様もありがとうございました。 マウスの初期胚の実験法に関する実験法、今後もご指導宜しくお願い申し上げます。 以上 失礼致します。

(無題) 削除/引用 No.970-32 - 2009/12/05 (土) 01:47:59 - あかね 面白い論文を見つけたので、紹介しておきます。 バスケットの中でFISHの全行程をやっています。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/pmc/articles/PMC1850761/

(無題) 削除/引用 No.970-31 - 2009/08/11 (火) 11:10:28 - みんみん >[Re:30] あかねさんは書きました : > みんみんさん、 > > メッシュを使って染色する方法は難しいといいながらも、興味あります。 > もし成功したら教えていただけないですか？ > > 以下、参考になると思います。 > http://jfly.iam.u-tokyo.ac.jp/html/manuals/pdf/J_96hole_immunostaining.pdf あかね様 ありがとうございます。 成功した暁には必ずご報告することをお約束いたします。 この度は度重なるご指導本当にありがとうございました。 改めて御礼申し上げます。 特に、論文は本当にためになりました。３Ｄの免疫染色およびＦＩＳＨというものがどういったものなのかも分からないでいた我々でしたが、明確なイメージを得ることができました。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.970-30 - 2009/08/10 (月) 20:13:49 - あかね みんみんさん、 メッシュを使って染色する方法は難しいといいながらも、興味あります。 もし成功したら教えていただけないですか？ 以下、参考になると思います。 http://jfly.iam.u-tokyo.ac.jp/html/manuals/pdf/J_96hole_immunostaining.pdf

(無題) 削除/引用 No.970-29 - 2009/08/09 (日) 21:10:17 - みんみん >[Re:28] あかねさんは書きました : > それと、核の形状が乾燥の際に変化するなら、Dropの中で固定した後に、スライドにのせてはどうですか？ あかね様 　論文ありがとうございます！３Ｄ-FISHを受精卵で行っている論文は見たことがなかったので、とてもありがたいです。私も後輩も感謝しております。精読させていただきます。 　ドロップ内での固定なのですが、私も考えておりました。ただ、論文ではどれも貼り付けた後に固定をしていたので、後々問題になるのではないかと考えていました。しかしこのままでは結果にもなりえませんので、早速明日試してみたいとおもいます。ありがとうございます！ >[Re:27] CJさんは書きました : > 網はいろんな会社が作ってますね。先ほどの例はアメリカのSmall Partsって会社のものですが、わざわざアメリカから輸入する必要はないと思います。日本で買ったときは、出入りの業者に適当に相談したら適当に適当なやつを持ってきてくれました（笑） > 網を円形に切って、セラムチューブを切ったものに取り付けるわけです。 > 網目が細かすぎると液切れが悪くなるので、試行錯誤は必要かもしれません。 ＣＪ様 　情報ありがとうございます。比較的容易に手に入りやすいものなのですね。 卵を保持できて、溶液はすり抜ける穴を持った網が入手可能かはわかりませんが、早速取引のある業者に依頼をしてみたいと思います。 どうもありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.970-28 - 2009/08/08 (土) 01:46:30 - あかね 以下、参考になると思います。 Changes of higher order chromatin arrangements during major genome activation in bovine preimplantation embryos Daniela Koehlera , b , Valeri Zakhartchenkoc , Lutz Froenicked , Gary Stonee , Roscoe Stanyonf , Eckhard Wolf c , Thomas Cremera , b ,⁎, Alessandro Breroc ,⁎ Experimental Cell Research 315 2053 2009 それと、核の形状が乾燥の際に変化するなら、Dropの中で固定した後に、スライドにのせてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.970-27 - 2009/08/08 (土) 00:51:57 - CJ 網はいろんな会社が作ってますね。先ほどの例はアメリカのSmall Partsって会社のものですが、わざわざアメリカから輸入する必要はないと思います。日本で買ったときは、出入りの業者に適当に相談したら適当に適当なやつを持ってきてくれました（笑） 網を円形に切って、セラムチューブを切ったものに取り付けるわけです。 網目が細かすぎると液切れが悪くなるので、試行錯誤は必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.970-26 - 2009/08/08 (土) 00:18:47 - みんみん >[Re:24] CJさんは書きました : > かごにつける網についてちょっと調べてみましたが、穴の大きさは５−１０００みくろんまで、いろいろな種類のものがあるようです。ですから、細かい穴のやつを購入すればいけるんじゃないかと思いますが、保証はできません。 ＣＪ様 お早いご返答ありがとうございます。 そのカゴというか網はどちらのメーカーから購入可能でしょうか？ 一度確認したいので、リンク先などを教えていただけますか？

(無題) 削除/引用 No.970-25 - 2009/08/08 (土) 00:14:19 - みんみん >[Re:21] あかねさんは書きました : > 3Dの場合はガラスボトムディッシュにドロップをつくって、そこにembryoを入れて観察します。 > CJさんが仰るように初期胚は大きいので3Dイメージを撮りたい場合はレンズから離れれば離れるほど、蛍光の取得が難しくなります。全体像のちゃんとしたデータを取りたいなら、2光子レーザーでworking distanceの大きいレンズを使って観察しないといけません。 > でもみんみんさんの場合は卵子に核が一個しかないので、観察する領域も大きな卵子の中のごく一部なので、それほど気にしなくて良いのではないかと思います。 > 3Dのことを気にする前に、FISHの立ち上げに力を入れるべきだと思います。 > Embryoは他の細胞とくらべて一筋縄ではいきませんよ。 > > 3DのFISHは全ての操作をドロップの中で行います。Hybriもです。 あかね様 ご忠告を無視するようなコメントしてしまい申し訳ありません。もちろん教えていただいたように今はスライドでのＦＩＳＨの系の立ち上げに着手いたしております。ただ、私のテーマとしては必要なのはImmuno-FISHであり、３Ｄに必ずしもこだわる必要がないのですが、研究室の後輩が３Ｄの系の立ち上げが必須なものがいるので、彼のためにも何かヒントをいただければと思い、３Ｄのことを細かくお聞きしてしまいました。失礼いたしました。 卵と胚のＦＩＳＨは核の数が増えると大変になるのですか？先行きが不安になるお話です。 ＭＡＳコートのスライドガラスを購入し、スライドガラス上でのＦＩＳＨのための貼り付け方を検討しているのですが、12日齢のマウスから成長過程の卵を用いた場合は核の形状を保持したまま貼り付けることができたのですが、ＧＶ卵にこの方法を試してみると、核小体が乾燥の工程で、崩壊していくのが見て取れ、その後ＰＦＡで固定、Tryton-Xで可溶化をした後にＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡で核の形を観察したところ、やはり前回と同様に核小体が原型をとどめていないほど核の構造が崩壊してしまいました。前回乾燥を確実に行うために、37℃で30分置いたせいで乾燥のさせ方が早すぎたためかと考えたので、今回は室温で穏やかに乾燥させたのですが、結果は同じでうまくいかず困っています。 今回行った方法を簡単に説明させていただきますと、 ・アシッドメムコで10秒ほど置き、透明帯を除去。 ・0.1%PBS/BSAで３回Wash ・PBS/BSAごとＧＶ卵をＭＡＳコートのスライドガラスに移し、ＧＶ卵の上端 　が空気に触れるか触れないかを残して吸注器でPBS/BSAを除去し、30分室温 　で乾燥 ・3.7%PFAで固定　室温10分 ・PBS/BSAで３回wash ・0.5％Tryton-Xで可溶化 室温15分 ・PBS/BSAで３回wash ・DAPIを含むベクタシールドでスライドを作成し、共焦点顕微鏡で核の形状を 確認 　ちなみに明視野では卵の輪郭は確認できたので、スライド作製の際に卵を押しつぶしてしまったということは考えられません。 今後のためにＧＶ卵でも核の構造を維持した染色像を得たいので、ＭＡＳコートに卵や胚を貼り付けから固定までの方法を教えていただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.970-24 - 2009/08/07 (金) 23:24:48 - CJ かごにつける網についてちょっと調べてみましたが、穴の大きさは５−１０００みくろんまで、いろいろな種類のものがあるようです。ですから、細かい穴のやつを購入すればいけるんじゃないかと思いますが、保証はできません。

(無題) 削除/引用 No.970-23 - 2009/08/07 (金) 23:23:30 - みんみん ＣＪ様 　こちらの本で正解ですか！とてもためになる情報をありがとうございます。早速購入をボスに掛け合ってみようかと思います。だめなら自費で中古本の購入を検討してみます。 　くぼんだスライドガラスなどというものがあるのですか！知りませんでした。勉強不足ですね。２光子顕微鏡は当方の研究棟にはなさそうです。検出には共焦点顕微鏡を考えていたのですが、これではできなそうですね。ちょっぴり雲行きが怪しくなってきてしまいました。 　 　色々とご指導下さいましてありがとうございました。とても助かりました。

(無題) 削除/引用 No.970-21 - 2009/08/07 (金) 22:14:29 - あかね 3Dの場合はガラスボトムディッシュにドロップをつくって、そこにembryoを入れて観察します。 CJさんが仰るように初期胚は大きいので3Dイメージを撮りたい場合はレンズから離れれば離れるほど、蛍光の取得が難しくなります。全体像のちゃんとしたデータを取りたいなら、2光子レーザーでworking distanceの大きいレンズを使って観察しないといけません。 でもみんみんさんの場合は卵子に核が一個しかないので、観察する領域も大きな卵子の中のごく一部なので、それほど気にしなくて良いのではないかと思います。 3Dのことを気にする前に、FISHの立ち上げに力を入れるべきだと思います。 Embryoは他の細胞とくらべて一筋縄ではいきませんよ。 3DのFISHは全ての操作をドロップの中で行います。Hybriもです。

(無題) 削除/引用 No.970-20 - 2009/08/07 (金) 21:51:13 - CJ みんみんさん 本はちょっと表紙が換わっているのが気になりますが、たぶんその本で良いと思います。 胚などのホールマウントを観察する際には特別なくぼんだスライドガラスや穴の開いたスライドグラスを利用して、その中に胚などを入れて、カバーグラスでふたをして観察するというのを読んだことがあります。ただ、共焦点で観察できる標本の厚みは５０ミクロンまでなので、そのあたりの技術的問題を克服する必要はあるでしょう（例えば2光子顕微鏡だったらＯＫ）。あかねさんのご意見を伺いたいところです。

(無題) 削除/引用 No.970-19 - 2009/08/07 (金) 16:18:11 - みんみん >[Re:14] あかねさんは書きました : > Oocyteの場合は細胞が大きいのでスライドグラスに貼り付ける時点でひしゃげてしまって、 > もとの構造を保つことができません。なので3D-FISHはスライドグラスを使わずにやるしかないです。 あかね様 ご返答ありがとうございます。 Chromosoma（2007）116:403-415の論文では、カバースリップに卵を貼り付けて行っているようなので、3D-FISHは何かに貼り付けて行うものとばかり思っておりました。 スライドガラスを使わないＦＩＳＨというのはどのように行うのでしょうか？当方では免疫染色に関して、Dishの蓋などに10数ulのドロップを置いて、吸注管を使って卵を移動させていき、抗体処理などを行っています。このように3D-FISHも吸注管を用いれば卵の構造を崩すことなく溶液処理することができるかと思いますが、最終的には共焦点顕微鏡で写真を撮る際に、ベクタシールドに閉じ込めるように押しつぶしてスライドを作成するので、結局は卵の形が崩れてしまって３Ｄではなくなってしまうのかも知れないと思っています。 　少しくらいなら潰しても良いのかなと考えているのですが、３Ｄ−ＦＩＳＨとはスライドの作成方法もまったく別物なのでしょうか？ 　初歩的な質問かもしれませんがどうぞよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.970-17 - 2009/08/07 (金) 15:35:13 - みんみん ＣＪ様 教えていただいた書籍と似たタイトルの本をアマゾンで発見いたしました。 http://www.amazon.co.jp/%E5%85%8D%E7%96%AB%E6%9F%93%E8%89%B2-situ%E3%83%8F%E3%82%A4%E3%83%96%E3%83%AA%E3%83%80%E3%82%A4%E3%82%BC%E3%83%BC%E3%82%B7%E3%83%A7%E3%83%B3%E6%9C%80%E6%96%B0%E3%83%97%E3%83%AD%E3%83%88%E3%82%B3%E3%83%BC%E3%83%AB%E2%80%95%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%83%BB%E3%83%97%E3%83%AD%E3%83%BC%E3%83%96%E3%81%AE%E4%BD%9C%E8%A3%BD%E3%81%8B%E3%82%89%E6%89%8B%E6%B3%95%E3%81%AE%E9%81%B8%E6%8A%9E-%E9%A1%95%E5%BE%AE%E9%8F%A1%E8%A6%B3%E5%AF%9F%E3%81%BE%E3%81%A7%E5%AE%9F%E8%B7%B5%E3%83%86%E3%82%AF%E3%83%8B%E3%83%83%E3%82%AF%E3%81%8C%E4%BD%99%E3%81%95%E3%81%9A%E3%82%8F%E3%81%8B%E3%82%8B-%E6%B3%A8%E7%9B%AE%E3%81%AE%E3%83%90%E3%82%A4%E3%82%AA%E5%AE%9F%E9%A8%93%E3%82%B7%E3%83%AA%E3%83%BC%E3%82%BA-%E9%87%8E%E5%9C%B0/dp/4897064198 いかがでしょうこちらの書籍が仰っていた書籍でしょうか？ 卵および初期胚のサイズの件ですが、私が実験に用いるのは100ミクロンよりももう少し小さい程度の大きさのものです。まだ書籍は手元にはありませんので、カゴとの適合性は判断しかねるのですが、いかがでしょうか？ 以上よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.970-15 - 2009/08/06 (木) 23:23:19 - CJ そういやマウスの卵、って書いてましたね。すみません。 大きさはどれくらいですか？網の大きさはいろいろありますので、あまり小さすぎなければうまいやつを選べるかもしれません。液交換で変形、というのはあるのかもしれませんが、それを言ったらＩＳＨのえぐい条件による変形のほうがよっぽど深刻では？卵はやったことがないので憶測ですが。

(無題) 削除/引用 No.970-14 - 2009/08/06 (木) 22:19:48 - あかね Oocyteの場合は細胞が大きいのでスライドグラスに貼り付ける時点でひしゃげてしまって、 もとの構造を保つことができません。なので3D-FISHはスライドグラスを使わずにやるしかないです。 それとCJさんがsuggestしているカゴですが、Oocyteには不向きだと思います。まず小さすぎて網をすり抜けるのではないかと思います。またwashの時点でbufferを交換する際にも、Bufferの流れでOocyteの形が変形するのでは？と想像します。やってみないと分からないですが、そのカゴはもっと発生の進んだ大きめのEmbryo向けだと思います。

(無題) 削除/引用 No.970-13 - 2009/08/06 (木) 21:46:55 - CJ かごを使う方法は切片や胚をスライドに貼り付けないで染色操作をするので、もちろん試料がなくなる心配もありません。 今その本は手元にないのですが、野路澄晴　編　最新免疫組織化学、in situ hybridization法　とかいったタイトルだったと思います。（2冊あったかもしれません。） 作り方は、セラムチューブを半分くらいに切り落とします。そして、セラムチューブのふたの先端を１ｍｍくらい切り落として、その残ったスクリューキャップのスクリューで網を固定する、というものです（理解不可能？）。これは24穴ウェルに収まる大きさなので、反応は２４穴ウェルで行い、かごを移すことで液交換をします。 私はこれの12穴ウェル用のものも用意して、補助的に使っています。

(無題) 削除/引用 No.970-12 - 2009/08/06 (木) 20:16:29 - マイス >[Re:9] CJさんは書きました : > 発生の人はホールマウントＩＳＨを好みますね。羊土社の本でホールマウント用のかごを作って（網とセラムチューブを切って作る）、それで液交換を行うことで標本のダメージを防ぐ、という方法が紹介されていました。私は切片でＩＳＨを行いますが、この方法は有効です。 ＣＪ様 ご指導下さいましてありがとうございます。また、教えていただいている立場ながら御礼をを申し上げるのが遅くなりまして失礼いたしました。 将来的には３ＤＦＩＳＨによる検出を目標としております。今回の予備実験的な免疫染色からも、またあかね様が仰るように、現状の方法では３Ｄとはいうことはできないと思います。そのホールマウント用のかごというのはこの問題を解決することもできそうでしょうか？ お教えくださった書籍の詳細な情報を教えていただけますでしょうか？ぜひ参考にさせていただきたく存じます。よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.970-10 - 2009/08/06 (木) 20:10:10 - ミンミン >[Re:8] あかねさんは書きました : > 初期胚をスライドの上に乗せた時点で3Dを保つことはできません。 > 3D (whole mount)でFISHする方法もありますが、初心者ならとりあえずスライド上でFISHを立ち上げるのを強くおすすめします。 > Good luck! あかね様 数日外出しておりまして、御礼を申し上げるのが遅くなりまして申し訳ありませんでした。 教えていただいたＭＡＳコートのスライドガラスを用いて、ガラス上に固定しての免疫染色を試みました。サンプルに３つのＧＶ卵を使用したのですが、３つすべて剥がれることなくシグナルを検出することができました。ありがとうございます。次はプローブを調製して、ＦＩＳＨを同様に行いたいと思います。今後ともご指導くださいますようよろしくお願い申し上げます。 ただ一つ気になるのは、ドライアップの際に、卵をガラス上に移した後にＰＢＳを除去して、乾燥させたのですが、ＧＶ卵の核が浮遊法で免疫染色した場合よりも「崩れた形」をしておりました。除去せずに残しておいたキュミラス細胞のゲノムは通常の免疫染色と同様の形状で検出することができました。 ＭＡＳコートではＧＶのような複雑なゲノム構造を保持したままのImmuno-FISHは不可能なのでしょうか？なにかコツがあるようでしたらご教授願えますでしょうか。よろしくお願い申し上げます。

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