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(無題) 削除/引用 No.962-7 - 2009/08/01 (土) 02:04:02 - にく よくわからないのですが これまでバンドが出現していたサンプル、抗体、試薬でも再現性がえられていないのでしょうか？ そうならば、イージーミスはないと仰られていますが、イージーミスがあるのでは？ washにつかっているTBSTやブロッキング剤の調整ミスとか。

(無題) 削除/引用 No.962-6 - 2009/08/01 (土) 00:56:53 - おお >[Re:5] cさんは書きました : > お話から想像するには、ブロッティング以前の行程に原因があるようにおもいます。ブロッティング装置は大丈夫でしょうか。wet typeだとスポンジがつぶれてくると密着が変な感じになってきてとくに真ん中あたりとかが転写不良になってきます。 スポンジの目が密になってきて、転写不良ではないかと 思える経験は私もしています。ちゃんと移っているようなんですが アミドブラックとかで染めているとなんか全体的にぼやーとしてるんですよね。マーカーだけだとあ、移ってるなっている程度で判断ができなかったと思います。で分離能がおちているというかバンドかシャープでないぶん検出感度が むちゃくちゃわるかったりするわけです。 あとはどうでしょうか、PVDFとか不良のロットが回ってきたとか、、、

(無題) 削除/引用 No.962-5 - 2009/07/31 (金) 23:15:55 - c お話から想像するには、ブロッティング以前の行程に原因があるようにおもいます。ブロッティング装置は大丈夫でしょうか。wet typeだとスポンジがつぶれてくると密着が変な感じになってきてとくに真ん中あたりとかが転写不良になってきます。それでも使っていると、末期は蛋白質が膜とゲルの間に流れてしまうのかほとんどまともに転写されなくなります。ホルダーも変形したり、ひび入ったりしてるやつも転写不良トラブルの原因になります。semidry　typeで炭素電極板とかだと経年劣化により変形したりして転写が著しくおかしくなります。とくに複数の転写装置がラボにある場合、ハズレ装置にあたると失敗します。前にそういう事（激しい転写ムラ、場所によっては広い範囲で全然転写されていない部分があるなど）があって、新しい装置に変えたら見違えるように転写パタンがきれいになりシグナルも強くバシッとなりました。マーカーははじに流すことが多いし色付きマーカーは比較的容易に転写されやすいので転写状態の確認には限界があります。膜はクマシーなりポンソーで染色されていますでしょうか。それにより転写状態をチェックできます。

(無題) 削除/引用 No.962-4 - 2009/07/31 (金) 19:20:34 - 通りがかり ECL DualVue Western Blotting Markers のような目視と ECL の両方で検出できるマーカーを使ってみてはどうですか？ マーカーが同じように転写されている事を目視で確認したメンブレンで、一方は ECL で検出でき、一方は検出できないとなると、何らかの原因で azide などがランダムに混入している事を疑う必要があるでしょう。例えばチップやチューブ、抗体を反応させたり洗ったりするトレイ、手袋やピンセットなどの使用器具などにコンタミしているのかもしれません。 マーカーはコンスタントに ECL で検出できるのに、サンプルは一切シグナルが出ないものがあるなら、HRPの活性が阻害されているわけではないですから、やはりまずは抗体が怪しいという事になります。読んだ限りではこの可能性は低そうですが、ともかく原因の切り分けにはなると思います。

(無題) 削除/引用 No.962-3 - 2009/07/31 (金) 18:47:43 - 濃 膜：ミリポアのPVDF ブロッキング：スキムミルク 一次抗体：非常に様々 二次抗体：プロメガ 検出：ECL あとは、二次抗体、スキムミルク、バッファー、ECLなどを違ったものに変えることが考えられると思います。たぶん違うなと思っていても、その考えが間違っていたということはよくあることです。

死なないで！ 削除/引用 No.962-2 - 2009/07/31 (金) 18:37:25 - orz とりあえず、できている人に頼み込んで ご自分のサンプルを渡してやってもらい、 できている人のサンプルをご自分でやって、 それでもご自分だけできないか確認する。

ウェスタンブロッティングでシグナルが全くでない 削除/引用 No.962-1 - 2009/07/31 (金) 18:03:17 - 死んでしまいそう 全く意味が分からなくて非常に困っていますのでどなたかお知恵を授けて頂けると助かります。 トピ名よりもウェスタンブロッティング（WB）でシグナルがでないことがあるという方が正確です。 はっきり言って私はWB初心者ではありません。これまでに幾度となくこなしてきましたが今回のようなことは初めてで非常に困惑しています。 非常に最近になって、低くない頻度でシグナルが全くでないと言うことが起こります。 これは特異的シグナルのみならず、非特異的シグナル、膜自体のバックグランドも含めてです。既に何度も確認しており、二次抗体の種を間違えたとか抗体を入れ忘れたとかそういう間違いではないです。 これは、一次抗体の種類、二次抗体の種類、サンプルの由来（細胞の種類）に因りません。同じ抗体、サンプルを使ってもなる時とならない時があります。 同時に何枚か膜をWBした時、そのうちのいくらかはシグナルがでないと言ったことも起こります。これは同じサンプルを使って、同じサンプルが同じように乗っている膜を何枚も作ってやっている場合も含んでいます。この時何枚かは問題なくWBが出来ており、試薬等がダメになったとは考えられません。また同じ試薬を他人が使ってWBしていますがその人は問題なくできています。 よくストリッピングしてからリブロットをしたりしていますが（これもこれまではちゃんとワークしていました）、一回目のブロットは問題が無くできていたのにリブロットでシグナルがでなくなると言うことも起こります。この場合も出来ているものは出来ているので分けがわかりません。 ストリッピングに問題があるかと思う方もいるかも知れませんが、この問題（シグナルでない）は一回もストリッピングしていない場合（最初のブロット）でも起こります。 そして一番困っているのはこの様に一旦シグナルがでなくなった膜は、ストリッピングしようがしまいが、モノクロを使おうがポリクロにしようがどんな抗体を使おうが二度とシグナルがでないです。 pre-stainedのマーカを使っていますが、膜上で目視できるマーカは問題のある膜と無い膜では違いが無く、どちらも色がついて見えます。 重ねて申し上げますが、十年以上WBをやっていますが全く初めての現象です。もちろん各ステップにイージーミスはないです。 あたかも膜にWB阻害物質（？）が不可逆的に付着しているのかと思えるほどです。 念のためもう少し使っている物を詳しく言いますと、（でも関係ないと思います） 膜：ミリポアのPVDF ブロッキング：スキムミルク 一次抗体：非常に様々 二次抗体：プロメガ 検出：ECL どんなことでも結構です、何か思い当たることがある方、助けて頂けると幸いです。

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