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(無題) 削除/引用 No.962-27 - 2009/08/08 (土) 06:16:02 - CJ もちろんこちらとしましても単に興味がある、ということですので、貴重なお時間をそこに費やせ、などと申し上げるつもりは毛頭ございません。何はともあれ実験が成功してよかったですね。継続してよい結果が出ることを祈っております。

(無題) 削除/引用 No.962-26 - 2009/08/08 (土) 02:05:38 - 死んでしまいそう レスありがとうございます。 もちろん落ち着いてきたらそのような検証も吝かではないですが、現状これまでの失敗を取り返すのが精一杯です。表裏逆にしても100％失敗するわけではありませんし、100％成功する確信もありませんし。つまり試すほどの余裕が正直今のところ無いです。信じていないとか言いながらすみません。 まず勘違いされないようお願いしたいのは、全ての場合でパラフィルムの表裏が影響するかと言うことです。今回、たまたま私の場合そこに原因があったとしても非常にまれなケースであったのでないかと信じます（パラフィルムが極めてまれにある部分だけ何かで汚染されていた？）。 普通そんなところが原因だと思わないですよね？少なくとも私は。とか言いながら、そこを変えたら（たまたま？）うまくいっているものですから。現段階の結果報告です。 しかし私は今後また逆をやらないでしょうね。それこそ験担ぎみたいなものですけど。

(無題) 削除/引用 No.962-25 - 2009/08/07 (金) 21:55:13 - CJ いつもパラフィルムは紙の側をサンプルにつけるようにはしていましたが、ちょっとショックな結果です。 お手数でなければ一度その表側、裏側の両方で同時に実験をして結果を教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.962-24 - 2009/08/07 (金) 18:18:38 - 死んでしまいそう > 後学の為に、パラフィルムのどちらの側を使うと 調子が悪くなってしまったのか教えてください。 使わないようにしますので。 紙のついていない方です。本当は紙のついている方を接触面にしていましたが反りの関係で暫く逆に使っていました。 しかし、本当にこれが原因かどうか分かりませんよ。

(無題) 削除/引用 No.962-23 - 2009/08/07 (金) 13:45:41 - orz 後学の為に、パラフィルムのどちらの側を使うと 調子が悪くなってしまったのか教えてください。 使わないようにしますので。

(無題) 削除/引用 No.962-22 - 2009/08/07 (金) 13:16:16 - 死んでしまいそう 一次抗体で処理する時にパラフィルムを用いているのですが、これの表裏を逆に使うようにしたら当該問題が全く発生しなくなりました。うそのようです。 本当にこれが効いたのか分かりませんし、いまだに自分でも全然信じられません。自分の中では結局原因不明に近いです。それかやはり超常現象か・・・。

(無題) 削除/引用 No.962-21 - 2009/08/04 (火) 08:55:37 - おお >[Re:19] そばさんは書きました : > 特に > >バンドどころかバックグランドも全くでない > というところが気になるんですよね。 > わたしもこの部分が鍵のような気がします。 検出キットか、2次抗体あたりでぶれているような、、、、 スキムミルクがコンタミでバクテリアとか増えているとか、、、 PBSTに菌が潜んでいるとか、、、、、 でコンタミをま逃れた時だけシグナルが見えているみたいな、、、

(無題) 削除/引用 No.962-20 - 2009/08/04 (火) 08:44:29 - 死んでしまいそう ありがとうございます。 > 一度イメージアナライザーの使い方で忘れている部分が無いか確認してみてください。 フィルムに焼いています。 蓄光シールを貼っていますが、これはくっきりと焼かれています。

(無題) 削除/引用 No.962-19 - 2009/08/04 (火) 01:32:13 - そば ウェスタンの検出をインスタントフィルムからイメージアナライザーに切り替えた時に似たような事を言っていた人がいましたが・・・。 その方はイメージアナライザーの絞りの調整を忘れていたのが原因でした。 （ちなみに私も自動絞りの機械からマニュアル絞りの機械に変わった時にド忘れして痛い目を見た） 他の方が全く同じ試薬で問題無く出来ているのであれば、一度イメージアナライザーの使い方で忘れている部分が無いか確認してみてください。 特に >バンドどころかバックグランドも全くでない というところが気になるんですよね。 誰かが機械の絞りを調整した後に（特にUV撮影で絞りを絞った後に）、気付かずそのまま使うとそういう事態に遭遇します。

(無題) 削除/引用 No.962-18 - 2009/08/03 (月) 04:25:15 - おお >[Re:15] 笑い男さんは書きました : > 　改名しないと地獄に送るわよ！！！という現象ですね。 私も解明した方がいいかしら、、、、、 ってかうけた。

(無題) 削除/引用 No.962-17 - 2009/08/02 (日) 13:47:46 - 死んでしまいそう 皆様、答えにくいトピックに沢山レスを付けて頂き本当にありがとうございます。 私の中ではいくらかの方のご指摘にあるようにトレイか何かが汚染している可能性が疑わしいような気がします。 ALP標識で検出するのはすぐに出来ないので、まずはこの点から攻めてみて、それでもダメならALP標識、その次は大殺界説、そしてもう暫くWBをやめるでしょうか。

文面からわかる範囲で。 削除/引用 No.962-16 - 2009/08/02 (日) 05:25:14 - 月詠 上手くいかないときは陽性シグナルどころか、ノンスペやバックグラウンドさえ全く検出されない（真っ白）という点がもっとも気になります。 このようにまったくシグナルが得られない原因として考えられるのは、 （イ）メンブレン上にＨＲＰがない 　　　→　二次抗体を入れ忘れた、異なる抗体を入れた　等 （ロ）メンブレン上のＨＲＰが完全に失活している／阻害されている 　　　→　何らかの変性・阻害物質（アジ化ナトリウム、メタノール、ＥＤＴＡなど）が混入した （ハ）基質・発光系（ＥＣＬ試薬）が完全に失活している のいずれかと考えざるえません。 まず、（ハ）の可能性については、他の人は上手くいっているし、いつも再現されるわけでもないので否定できます。 （イ）のうち、異なる二次抗体を入れてしまった場合でも、多少のノンスペやバックは出てもおかしくありません。また、もし、転写がうまくいかず、メンブレン上に抗原が存在しなかったとしても、一次抗体あるいは二次抗体のメンブレンへの非特異的吸着によって多少のバックグラウンドがあってもおかしくはありません。 にも関わらず、（二次抗体を入れ忘れたわけでもないのに）まったくシグナルが得られないということは、”そのメンブレン”上のＨＲＰ酵素の活性が、何らかの原因によって完全に阻害されてしまっていると考えざるえないと思います。 ＨＲＰの活性を阻害する因子としては、アジ化ナトリウム、パラホルムアルデヒドやメタノールなどの固定薬、あるいはＥＤＴＡなどのキレート剤などが考えられ、これらの阻害因子が系に持ち込まれる可能性は、ブロッキング剤（スキムミルク）、洗浄用のバッファー、あるいはトレイ（の洗浄が不十分）に由来する場合しかありません。 もし、同じロットのブロッキング剤と洗浄用バッファーで上手くいく場合もあるのであれば、残された可能性はトレイからの持ち込みということになります。

解決にならないですが・・・ 削除/引用 No.962-15 - 2009/08/02 (日) 00:39:57 - 笑い男 　厄払いをするとか、賽銭の金額をあげて神頼みする・・・とかいうレベルの質問ですよね。最近テレビで見ない人の言葉を借りれば大殺界ですあなたは！改名しないと地獄に送るわよ！！！という現象ですね。 　一次抗体以外は全て共通の試薬であるなら、手技の問題でしょうね。 キャリアを捨てて初心に帰ること（変な思い込み（自信）はないですか？）も、時には大事ですよね。　正直言って、ツキが無いときは何をやっても上手くいかないっと、自分を納得させるのも時には必要であるという考え方で今まで実験してきています。（しばらくウェスタンから離れてみるのも一つの解決方法であると考えています。） 　試薬のロットが変わったとか？（自分だけが使っている試薬において） 　同僚よりも界面活性剤の濃度が高いものを使っているとか？（下げてみるとか？・・・今の条件が、成功/失敗を決めるギリギリであって、バックは覚悟しつつシグナルを増やすように努力するととか？） 　バラつくことが実験ミスではなく本当の真実であるとか？（検出できないものは、タンパクが存在しないからだと解釈するとか・・？） 　転写装置は新しいが、ＰＶＤＦ膜を置く位置によって、転写効率が大きく変化するとか？（装置不良で、膜を置く位置が影響していたとか？） 　うーん、、、、、オーバーブロッキングになったことで、一回も光らなかった膜は一次抗体すら結合していない→だからＨＲＰで光らないとかの確認は人用でしょうし・・・。 　（私自身もＡＰ標識の二次抗体で確認するアイデアはいいなーと思います。） 　ごめんなさい。正直言って私もお手上げです。

(無題) 削除/引用 No.962-14 - 2009/08/01 (土) 21:42:28 - ami 洗い中に膜が乾いている

(無題) 削除/引用 No.962-13 - 2009/08/01 (土) 20:36:26 - TK ＞そして一番困っているのはこの様に一旦シグナルがでなくなった膜は、スト ＞リッピングしようがしまいが、モノクロを使おうがポリクロにしようが ＞どんな抗体を使おうが二度とシグナルがでないです。 このシグナルがでなくなった膜をCBBなどで染めるとどうなりますか？ 見た目に変化はないのでしょうか？ どのタイミングでシグナルが検出できなきなったのか 実験ノートで確認してみてください． つまり抗体を使い回しすぎたためにシグナルが検出できなくなったとか，そうではなくてランダムに起きているのかなど． また，ブロッキングのバッファーなどを新しく作り直した直後はうまく検出できているけど，作り置きしておいたものを使用したときは検出できなかったとか． まず，ブロッキングのバッファーなどを新しく作り直す． または，同僚から分けてもらったものを使ってみる． それと使っている水の質が悪かったというのはないですか？

(無題) 削除/引用 No.962-12 - 2009/08/01 (土) 17:31:59 - 死んでしまいそう > その「ダメになった」メンブレンを、ALP 標識の二次抗体を使って検出してみるというのはいかが？ なんとすばらしいアイデア！！ すぐに試してみたいけれど、現在手元にALP標識二次抗体も検出システムもないのですぐに試せない・・・

(無題) 削除/引用 No.962-11 - 2009/08/01 (土) 16:16:31 - 通りがかり その「ダメになった」メンブレンを、ALP 標識の二次抗体を使って検出してみるというのはいかが？ これでシグナルが出るようなら、何らかの HRP 阻害剤混入の可能性がますます濃厚になります。

(無題) 削除/引用 No.962-10 - 2009/08/01 (土) 15:47:42 - 通りがかり > 上述したような状況なのでこれも光らないような気がします。 私も多分そうだろうと思いますね。 > ご指摘のように何かが阻害しているような気がします。 外来の要素の可能性が否定できませんから、チューブやチップその他は箱から出した新品を WB 専用で使って、使い残しや使用器具類は使い終わったらすぐに鍵のかかる机等で保管する、ブロッキングや抗体反応・洗浄も封のできる容器中で行うなどしてみてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.962-9 - 2009/08/01 (土) 15:33:35 - あいうえお スキムミルクがくさっている 同僚に恨まれていて試薬になにかをコンタミされている

(無題) 削除/引用 No.962-8 - 2009/08/01 (土) 15:10:33 - 死んでしまいそう 皆様沢山のレスを本当にありがとうございます。 だらだらと長く書いてしまったためか、多少うまく伝わらなかったところがあるようですので示し直します。 同一のサンプルから複数枚の膜を作って、様々な抗体でWBすると言うことをよくやっていました。重要な点をもう一度強調しますと、 1.それらの中から何枚か全くWBできない（バンドどころかバックグランドも全くでない）ことがある。 2.運良く（？）全ての膜で一度目はWBできた場合でも、リブロットした時に何枚か全くWBできないことがある。 3.始めにWBできた膜も一度出来なくなってしまうと二度とどんな抗体を使ってもWBできなくなる。 4.ダメになる前と後でpre-stainedマーカに差は見えない。 5.サンプル、抗体その他は皆使い慣れたものを用いている。 6.同僚とWBの試薬、PVDF、装置は全て共有しているが自分だけこの現象が起こる。試薬の回転は比較的速い。 です。 したがって、 ・どの膜も全くうまくいかないわけではないのでサンプルに問題があるとは思えない。 ・一度はWBできていることから転写を失敗している膜ではない。しかも膜自体にバックがでるような抗体の場合でも真っ白で、既に転写云々というレベルにも達していない。アミドブラック等で染めてみてもいいのですがそこに問題があるのではなさそう。 ・この問題を抱えながらぐずぐずしているうちに試薬はかなり回転している。転写以降の過程で交換してみるべき試薬が既に見当たらない。 と、考えます。 ちなみに転写はセミドライでやっています。装置は新しく劣化していません。 ほとんど毎日複数枚の膜を使ってWBしているので毎回毎回イージーミスをしているとは思えません。 >ECL DualVue Western Blotting Markers のような目視と ECL の両方で検出できるマーカーを使ってみてはどうですか？ マーカーが同じように転写されている事を目視で確認したメンブレンで、一方は ECL で検出でき、一方は検出できないとなると、何らかの原因で azide などがランダムに混入している事を疑う必要があるでしょう。例えばチップやチューブ、抗体を反応させたり洗ったりするトレイ、手袋やピンセットなどの使用器具などにコンタミしているのかもしれません。 マーカーはコンスタントに ECL で検出できるのに、サンプルは一切シグナルが出ないものがあるなら、HRPの活性が阻害されているわけではないですから、やはりまずは抗体が怪しいという事になります。読んだ限りではこの可能性は低そうですが、ともかく原因の切り分けにはなると思います。 こういうマーカがあるのですね。上述したような状況なのでこれも光らないような気がします。しかし、バックもでないという言い方はあまり説得力がないので、仰るように可能性を探るには有用ですね。ご指摘のように何かが阻害しているような気がします。 未だこの現象が起きていて、もう自分の身体から何か悪いものがでるようになったか、頭が馬鹿になったか夢遊病になって無意識のうちに何か違うことをやっているのではないかと思えてきます。

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