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(無題) 削除/引用 No.960-2 - 2009/07/31 (金) 21:53:22 - CJ 1次抗体を標識する方法は検出感度に難がある気がします。 前に知り合いがやっていた方法でＴＳＡ法（Perkin-ElmerとかInvitrogenが出してます）を使う、という手があります。 まず、通常の蛍光法で検出できない限界の1次抗体の希釈倍率を検討します。 そして 1.限界倍率よりも希釈した1次抗体 2.ビオチン化2次抗体 3.ＡＢＣ 4.ＴＳＡ反応で蛍光標識 5.2個目の1次抗体 6.蛍光2次抗体 とやります。 この手法のみそは、ＴＳＡ法はＡＢＣ法の5倍くらい、つまり通常の2次抗体蛍光法の10倍以上の感度があることで、1.の1次抗体は通常の10倍以上の希釈倍率で使用することが可能になります（高い1次抗体をケチる、というおまけ付）。このため6.の2次抗体は実質1.の抗体を検出することができなくなるのです。 欠点は、条件検討が厄介である、ということと、各種コントロール実験が必須になる、というところでしょうか。

少量の１次抗体をビオチン化する方法 削除/引用 No.960-1 - 2009/07/31 (金) 13:58:43 - たぴお みなさん、こんにちは。 こちらは大学院で研究して３年目の者です。 今、ヒトの血管あるいはリンパ管内皮細胞の蛍光染色を試みています。 ２種類の１次抗体AとBで二重の蛍光染色をしたいのですが、 どちらも同じ動物(mouse)由来で作られた抗体であるために、 「１日目に１次抗体A→２次抗体(alexa fluor etc)でincubate」して染色し、 「２日目に１次抗体Bをビオチン化したもの→alexa fluor ストレプトアビジン」 の方法で２重染色をしたいと思っています。 （Zenonのラベリングキットはworkしなかったため） ミルテニー社からone-step antibody biotinylation kitが 売られているのですが、8回分で25000円と高く、 http://www.miltenyibiotec.com/jp/PG_707_817_One_Step_Antibody_Biotinylation_Kit.aspx また同仁化学からのbiotin labeling kitが50μg以上からのタンパク標識可能とのことで、使う抗体量が多く、1次抗体が高くで貴重なので 買うのにちゅうちょしてます。 http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr5.nsf/View_Display/LK03?OpenDocument どなたか、少量の1次抗体をビオチン化する方法をご存じでしょうか？ どうかなにとぞよろしくお願いします。

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