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(無題) 削除/引用 No.959-10 - 2009/08/05 (水) 00:11:41 - おお >[Re:9] G氏さんは書きました : > おおさん > 「タンパク濃度を上げすぎるとRNA結合能が低下する」ということに何か意味があるのかもしれないと考えています。 > なるほど、実験から考えていらっしゃることが分かってきました。 どうでしょうか、メカニズム的には構造変化を伴いそうですが、 うまく説明できるモデルを組めますでしょうか、、、、 アロステリック(と言っても従来の逆の)的なものが関与しているかも しれません。 RNA結合ドメインは分かっているのでしょうか? そのRNA結合ドメインだけで結合を見た場合同じようなことが起こりますでしょうか? たんぱく質が2個所RNAが結合できるところがあって、低親和性の方にRNAが結合すると、構造変化が起こるとか、、、、 とにかく、キネティクスが綺麗にえられて2相性を示すなら 面白いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.959-9 - 2009/08/04 (火) 14:47:48 - G氏 おおさん タンパク濃度に関しては、必ず濃度を上げないといけないわけではありませんが、、、 「タンパク濃度を上げすぎるとRNA結合能が低下する」ということに何か意味があるのかもしれないと考えています。 でも精製したタンパクといえど、不純物やヌクレアーゼが混ざっていてもおかしくないですね まだまだ注目するタンパクについてはわからない事だらけですが、そこが面白いところでもありますね

(無題) 削除/引用 No.959-8 - 2009/08/03 (月) 05:30:19 - おお >[Re:7] G氏さんは書きました : > おおさん、ありがとうございます。 > > 説明が不十分で分かりにくいと思いますが、同じ条件下でも、タンパクとRNAのコンプレックスが見れる時と見れない時があるということです > > 現在はRNAの量を一定にし、タンパクの濃度をいじっています。あるタンパク濃度までは、タンパク濃度に比例して結合RNA量が増加しているのですが、その後結合RNA量が減少するという結果も何度か得られています。 > どの様なレシオで結合が見れなくなるのかよく分かりませんが、 2相性があると言う事でしょうか、、、、 でそこまで濃度を上げて実験をしないといけない理由は何でしょうか。 たんぱく質に微量のヌクレアーゼが存在し、高濃度ではインヒビター を加えても無視できない量になる可能性はないでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.959-7 - 2009/08/02 (日) 13:00:51 - G氏 おおさん、ありがとうございます。 説明が不十分で分かりにくいと思いますが、同じ条件下でも、タンパクとRNAのコンプレックスが見れる時と見れない時があるということです 現在はRNAの量を一定にし、タンパクの濃度をいじっています。あるタンパク濃度までは、タンパク濃度に比例して結合RNA量が増加しているのですが、その後結合RNA量が減少するという結果も何度か得られています。 私の注目しているタンパク同士がダイマー等のコンプレックスをつくるというデータは今のところ無いですし、リコンビナントタンパクの濃度を上げすぎてRNAと結合しにくくなる構造をとってしまっているのかもしれないですね。 ご指摘のとおりMg++やCa++、塩濃度は試してみる予定です。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.959-6 - 2009/08/01 (土) 01:15:39 - おお >[Re:5] G氏さんは書きました : > タンパク質、RNAが古くなったのではと作り直しても、スーパーシフトが安定しないのです。 > タンパク、RNAのコンプレックスがシフトしないということでしょうか? それともタンパク、RNAのコンプレックスが見れる時と見れない時が あるということでしょうか? もし条件自体が、そのコンプレックスにとって非常に微妙で 結果が安定しない可能性があるなら、若干条件をいじってみる のもてかもしれません。 電気えいどうのバッファーのEDTAを抜いてみるとか、 反応溶液のMg++の濃度をちょっとあげてみるとか、 Ca++をちょっとくわえてみるとか、塩濃度をちょっと下げてみるとか、、、 あとリコンビナントとか場合によっては活性てきに不安定かもしれません。 毎回フレッシュなものでやらないとうまく行かないというしんどいケース も想定できます。 取れてきたリコンビナントの質の評価って難しいことがたたありますので このへんはこまったものです。

(無題) 削除/引用 No.959-5 - 2009/07/31 (金) 18:10:39 - G氏 ；さん 同じときに作ったタンパク質、RNAを使用して実験しても、その時によって結果が異なるということです。 タンパク質、RNAが古くなったのではと作り直しても、スーパーシフトが安定しないのです。 ご指摘のとおり、ピペッティングでやってみる予定です。 あと、反応時や泳動時の温度も何パターンか試してみたいと思います。 返答ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.959-4 - 2009/07/31 (金) 13:49:29 - ； 同じときに作ったタンパク質 同じときに作ったRNA これらを使用して実験しても、その時によって結果が異なるということでしょうか？ 状況がよくわからないので何とも。 タッピングに疑いを持っていらっしゃるのであれば、 〜回〜のピペットマンでピペッティングする、とか決めてしまえばいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.959-3 - 2009/07/31 (金) 13:38:33 - G氏 ；さん、ありがとうございます うまくいかなくなって１ヶ月・・ RNAやタンパクは新しく作り直したりしてるのですが・・ 条件を一定にしても、結果は一定にならないのです

(無題) 削除/引用 No.959-2 - 2009/07/31 (金) 13:09:57 - ； 混ぜる時だけの問題とは限らないのではないでしょうか？

ゲルシフトがうまくいきません 削除/引用 No.959-1 - 2009/07/31 (金) 12:58:49 - G氏 はじめまして ゲルシフトアッセイを用いて、あるタンパクとRNAの結合を見ています。 タンパク濃度の増加と共にRNA結合量の増加が見られたのですが、再現性を取ろうとしたところ結合量にバラツキが出てしまいました。 皆様はゲルシフトを行なう際、タンパクとRNAをどのように混ぜているのでしょうか？ 私はタッピング後に静置するのですが、これではサンプルごとにムラが出てしまいますよね・・・ 皆様のご意見をお聞かせください。よろしくお願いします。

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