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(無題) 削除/引用 No.958-16 - 2009/08/05 (水) 11:35:27 - おお 膜の裏打ち、、と言う事なのでクラスリンとかでしょうか、、、 結合あいてと言う事はおいておいて、機能としてなにか 有用なデーターになれば利用価値がありそうですね。 なかなか直接の結合相手を見つけるというのは、サイトゾル にある可溶性のたんぱく質でも根気が入るのに、膜のトポロジー なんかも解決しないといけないとなると、確かにちょっと やる事が難しくなってきているのかなとはおもいます。 膜に埋もれていないかどうかとかプロテアーゼ処理を使うことが ありますね。ただし、断片化されたペプチドが抗体で認識されないと 結論が出ないですが、、、 マスのデーターで信用できそうな、比較的よくあなたのタンパクをCo-IP できるものを探して見てはどうでしょうか? もしかしたら、あなたのタンパクでIPしさらにそのタンパクでIPする事で もっと正確に複合体を回収できるかもしれないですし、それでもう一度 マスに持ち込むとか、複合体のキャラクタライズをするところから 突破口が見つかるのではという気がしてみました。

(無題) 削除/引用 No.958-15 - 2009/08/04 (火) 13:59:42 - S おおさん。まさしく、仰られるように最初、野生型の膜タンパク質と当該isoformがCysにて会合して、分泌されないのだと予想しておりました。ただ、残念ながらCo-IP実験を用いて完全に否定されてしまいました。これが出来ていたら今頃は、、、。 濃さん。MSの結果、分かりにくい表現で申し訳ありません。取れてきた分子は、細胞内に存在する細胞裏打ちタンパク質の種類が多かったということです。 通りがかりさんが書かれているように、Crypticな膜貫通配列があれば良いのですが。何か証明出来る方法があれば良いのですが。人工脂質二重膜に精製タンパクを振りかけるとかですかね・・・。もしこの分子が膜タンパクであれば、前回のMSの結果が生きるのですが。 あとは、皆さんからのアドバイスのように、別の系で同定を試みることですかね。 皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.958-14 - 2009/08/03 (月) 04:46:33 - おお >[Re:11] Sさんは書きました : > 皆さん、参考になるアイデアありがとうございます。 > 　　細胞膜画分でのMSというのも考えておりました。ただ、今回取れてきたタンパク質の多くが細胞膜タンパクとダイレクトに結合するもので、多分、膜画分を取ってきてMSしても同じようなものが取れると考えております。 それは、前回の実験が何処まで信用できるかによると思います。 もし、信用できるのなら、そのデーターから解釈を進めていくべきです あと、マスで行き詰まりを感じるなら、 大腸菌、ファージ、イーストで発現スクリーニングを 考えても良いのではないでしょうか、、、 たしかに分泌タンパクなのでトリッキーな場合もたたありますが、、、 クロスリンクはよくライガンドのリレプタークローニングに使われます。 そのバリアントは膜貫通型アイソフォームとヘテロマルチマーをつくって 膜貫通型のサイトゾリックの部分に結合するたんぱく質を拾ってきている 可能性はないでしょうか。そういった場合SHを介して結合しているなら、 実験条件次第ではコバレントなので、培養じょうせいにでてこなかったり、 してもおかしくないですし、、、、

(無題) 削除/引用 No.958-13 - 2009/08/02 (日) 20:49:34 - 濃 >細胞膜画分でのMSというのも考えておりました。ただ、今回取れてきたタンパク質の多くが細胞膜タンパクとダイレクトに結合するもので、多分、 >膜画分を取ってきてMSしても同じようなものが取れると考えております。 >可溶化して膜タンパクと当該タンパクが乖離してしまうということは充分に考えられます。その場合はどうしたら良いでしょうか？ 前には、細胞内タンパクばかり（結合対象として？）とれてくると書いていますけど、細胞膜タンパクの細胞内表在性部分との結合が考えられるということでしょうか？ 細胞膜タンパクの細胞外表在性部分と結合しているのなら、あまり不思議ではない気がしますが。 結合実験は（タグをつけて）IP-ウエスタンが一般的ですが、、、現在これができないと論文としては結合しているといえませんよね。IPのときはデタージェントをふつう使いますので、IP-ウエスタンで検出できるのはほとんどすべてデタージェント抵抗性の結合だと思います。

(無題) 削除/引用 No.958-12 - 2009/08/02 (日) 18:09:05 - 通りがかり 別に MS だけが結合蛋白同定法じゃないですよ。 ふりかけ実験がうまく行くようなら、古典的な発現クローニングを行えばいいのでは？ しかしどうも cryptic な膜貫通領域があるような気がしますね。 FACS に使ったのはN末抗体ですか？C末抗体ではFACS等で染まらず、膜透過処理をほどこすと染まったりしませんか？

(無題) 削除/引用 No.958-11 - 2009/08/02 (日) 17:58:53 - S 皆さん、参考になるアイデアありがとうございます。 　　もう少し詳しく具体的に私の実験について連絡させて頂きます。私の興味あるタンパク質は、細胞膜タンパク質のalternative splicing variantで細胞膜、細胞質領域が欠損しております。ですので普通に考えれば、可溶性タンパク質です。ただ、その分子は、培養上清のウエスタンブロットや、さらには35Sラベルした細胞上清にも検出できません。FACSや細胞lysateで検出できます。 　　細胞膜画分でのMSというのも考えておりました。ただ、今回取れてきたタンパク質の多くが細胞膜タンパクとダイレクトに結合するもので、多分、膜画分を取ってきてMSしても同じようなものが取れると考えております。 　　可溶化して膜タンパクと当該タンパクが乖離してしまうということは充分に考えられます。その場合はどうしたら良いでしょうか？？クロスリンカーみたいなものを使えば良いのでしょうか？可溶化剤の検討でしょうか？ただ、その場合、評価が私の場合、難しいと思いますが。 　　ヘパラン硫酸というのも、考えておりましたが、その様な糖を介する結合ではある程度は培養上清に漏れ出てくると思いますので、35Sで検出できたはずであると思います。また塩基性アミノ酸が集まっている箇所も見つけられません。 　　リガンドとして作用しているという可能性はあると思います。ふりかけ実験。是非試してみます。ただ、それでうまくいった場合、次にはやり結合膜タンパクの同定になりますので、MSでやはりまた同じ問題に行き着いてしまいます。 　　現在は、ファーウエスタンを試してみようと考えております。 　　本当にどんな些細なことでも良いので、何か気づいたら、さらにはアイデアがあれば、是非、是非ともお教え頂ければ幸甚です。何卒よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.958-10 - 2009/08/01 (土) 18:55:53 - aji 膜表在性タンパク質でコンピューター解析の結果、膜タンパク質と評価されるものってかなり少ないと感じているのですが、そのような可能性は低いですか？ 膜貫通領域無し、リガンド不必要な膜表在性、よくある話だと思います。ただ、当方は細胞表面のことはほとんど知りませんので、細胞表面では滅多に無い現象なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.958-9 - 2009/08/01 (土) 00:22:58 - おお 本当に膜に埋もれてないかというのもちょっと興味がありますね。 プレディクションの現在の正確さはよくわかりませんが(そこそこ 確実とおもうのですが)、予測しそこねている可能性は否定できない かもしれません。 例えば20アミノ酸くらいからなるヘリックすは構造予測で みつかりますでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.958-8 - 2009/07/31 (金) 22:05:46 - ats II型膜タンパク?

(無題) 削除/引用 No.958-7 - 2009/07/31 (金) 19:22:44 - 濃 ＞当該タンパク質を精製して、Mass Specで同定を試みたところ、細胞内タンパク質しか取れてきません。膜タンパク質は一つも取れてきません。 相互作用するタンパクとして細胞内タンパク質しか取れてこないなら、（また、細胞外という仮定が100％正しいなら）検出は非特異的なのでしょう。この可能性が高いなら、よく洗った膜画分から精製をスタートすべきですが、やっていますか？ すでに指摘のあるように、細胞膜表在性の非タンパクと結合している可能性は常にあります。

(無題) 削除/引用 No.958-6 - 2009/07/31 (金) 10:31:02 - おお お困りのとのこと、そういう訳の分からない状況って結構あるんですよね。 まず局在として細胞表面らしいというのはそのようです。 固定して免疫染色とかはされましたでしょうか? あるいはお使いになっている抗体でウエスタンで ノンスペみたいなものが見られますでしょうか? イーストで分泌するタンパクが核にも存在したという ものを見たことがあります。FGFは転写翻訳位置が 変わることにより核に発現したり、分泌されたりしますね。 膜表面と同時に他のところにも発現している可能性も 考えられるかもしれませんね。 もし膜に存在してそのパートナーを探そうとしているのなら、 まくフラクションをとってそれをスタートマテリアルにして プルダウンなどで精製していってMSに持っていった方が いいかもしれません。最近のMSは感度よすぎるなあという 感じがありますから、何でもひっかかってきそうな気がします。 MSの解析でそのシグナル配列の部分は見つかりましたか もしそうならちょっとストーリーを変えないといけないかもしれませんね。 膜上にあるとしてどの様に膜にとどまっているかは可能性としては 幾らかあるとは思いますが(私が検討つかないものをふくめ) コラーゲンとかも立派な分泌タンパクで感触としては 細胞表面にベタベタついているような感じですし、 サイトカインやグロースファクターなどもヘパリンなどと 親和性があり、細胞表面にとどまっているものも 結構あります。 例えば過剰発現するとバイチに検出されるとかないでしょうか? 膜に間接的についている場合膜フラクションを取ってきて バッファー条件をいじって(高塩濃度とか、pHなど) 膜から解離するかどうか見るという実験もあります。 高濃度TRISが解離に有効だったというタンパクもあるようです。

(無題) 削除/引用 No.958-5 - 2009/07/31 (金) 10:14:32 - 通りがかり 精製した蛋白を細胞に振りかけてみてはどうですか？ それで膜表面に局在するようなら、蛋白か糖鎖か何かは知りませんが、ともかく膜表面の何かに結合しているという事になるでしょう。 そこで例えばトリプシン処理した細胞には結合しないとなれば、膜蛋白に結合している可能性が高いと予想できます。

(無題) 削除/引用 No.958-4 - 2009/07/31 (金) 10:09:28 - 通りがかり > Mass Specで同定を試みたところ、細胞内タンパク質しか取れてきません。膜タンパク質は一つも取れてきません。 それはあまり当てになりませんよ。細胞を融解した時点で解離するケースはいくらでもあります。特に膜蛋白の場合は界面活性剤を使って可溶化するわけですし。取れてくればいいですが、取れてこないからと言って結合していないとは全く言えません。 リガンドとしてであれ何であれ、膜蛋白と結合している可能性がやはり一番高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.958-3 - 2009/07/31 (金) 09:48:56 - う 検出されている量がどのくらいか全く想像できませんので適当に。 なんてことはない、単純に、リガンドとして結合している。 あるレセプターを検出するのに、 レセプター→それに結合するリガンドtag付き→tagに対する抗体（標識されている） で、FACSで検出する方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.958-2 - 2009/07/31 (金) 09:12:19 - M 細胞表面ってことなら、 ヘパラン硫酸とかにトラップされているとか・・・

可溶性タンパク質なのに何で膜上に？ 削除/引用 No.958-1 - 2009/07/31 (金) 08:53:01 - S 非常に困っているので誰かアイデアを教えて下さい。 私の興味あるタンパク質は、コンピューター解析においては、シグナル配列を含んでいて、細胞膜貫通領域は含んでおりません。分泌性タンパク質の可能性が高いと予想されます。しかし、そのタンパク質は通常のFACSで検出でき、さらに細胞表面のビオチン化でも検出できるので、細胞膜上に存在するということが分かりました。 当初は、細胞膜タンパク質と結合することによって膜表面に出ているのではと思い、当該タンパク質を精製して、Mass Specで同定を試みたところ、細胞内タンパク質しか取れてきません。膜タンパク質は一つも取れてきません。 このような状況なのですが、どのように当該タンパク質が膜上にあるか、可能性のあるアイデアをお持ちの方がおられましたら是非、是非お教え下さい。ちなみにGPIアンカーの可能性も低いと思います。 何卒宜しくお願い致します。

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