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(無題) 削除/引用 No.954-16 - 2009/08/05 (水) 02:07:12 - とりとん >>APさん ありがとうございました。 一先ずラボにある免疫系の教科書にあたってみます。

(無題) 削除/引用 No.954-15 - 2009/08/02 (日) 23:39:34 - AP >つまりAPさんが仰るように10前後に断片化され、そのうちの特にエピトープとして優位な領域が選択される、つまり断片化領域＝抗体の認識配列では無い、という理解で良いのでしょうか？ 明確な答えを持っていませんが、免疫学や抗体の応用に関する教科書あたりには書いてありそうです。 >つまり断片化領域＝抗体の認識配列では無い、という理解で良いのでしょうか？ ではないんでしょうね。提示されるペプチド断片は、エピトープになるのに十分な配列であって、必要十分な配列が選ばれて提示されるわけではないでしょうから。

(無題) 削除/引用 No.954-14 - 2009/08/02 (日) 23:22:44 - AP たしかにT-cell非依存性で、B-Cellレセプターが直接抗原と結合することによる、B-cellの活性化・抗体の産生もあり、この場合は高次構造によってのみ生じるエピトープを認識する抗体ができる可能性もあるので、私の説明は片手落ちだったかもしれません。 しかし、免疫原のリフォールディングにこだわっている人たちの中に、そういうことまで意図してやっている人がどれだけいるのかはなはだ疑問に思っています。ましてや、目的がウェスタンブロットであったり免疫染色であるという時に（多くの場合そうだと思いますが）、netiveなフォールディングしたタンパク質しか認識しない抗体ができても使えません。 深い考えなしに、闇雲に免疫原タンパク質の可溶化、リフォールディングにこだわり、それで仕事が先に進まないという事例も見受けられるのを憂慮したまでです。 実際、nativeなタンパク質のみを認識する抗体というのはありますが、意図的に狙わないで、漫然と免疫するだけでも取れてくるんでしょうかね。そういうのを取りたい時は、それを狙ったプログラムで、最終的にはモノクロをとったりするんじゃないでしょうか。たとえば、、ELISAや免疫染色では反応するけれど、westernなどでunfoldingしたタンパク質には反応しない抗体がとれたことは私自身の経験にはなく、研究室全体でもそういう例はひとつあったのみです（denatureしたタンパク質には反応するけれど、nativeには反応しにくいという、逆のパターンは多いですが）。

(無題) 削除/引用 No.954-13 - 2009/08/02 (日) 21:27:18 - im APさんは ＞不溶化したタンパク質や、界面活性剤や変性剤によって変性したタンパク質では、インタクトなタンパク質に対する抗体ができない、リフォールディングしてから免疫しなければならない、などど主張する人がいますが、抗原に対して、免疫系がどのようなプロセスで抗体を産生するのか（たとえば、抗原の貪食、断片化とエピトープ提示）という免疫学の基本を忘れてるんじゃないかと、常々思っています。 と書かれてますが、短いペプチド配列ではなくて完全に立体構造特異的な抗体は普通にあるわけです。確か、これは、抗原提示-TCRではなくて、BCRによるものではなかったでしたっけ？免疫学の基本だとは思いますが、良く覚えて無くてごめんなさい。ともかく、リフォールドしてから免疫したら、短い断片に対する抗体ができることに加えて、nativeな構造を認識する抗体ができる可能性が出てくるから、全体として成功率が上がる、ということは理屈と思いますよ。そうしなくてもできたということは、もちろんありえるでしょうけど、

(無題) 削除/引用 No.954-12 - 2009/08/01 (土) 11:37:30 - とりとん >>APさん、質問者様含め皆さん すいません。トピとは外れますが、もし御存知でしたら後学の為に教えて下さい。 >抗原に対して、免疫系がどのようなプロセスで抗体を産生するのか（たとえば、抗原の貪食、断片化とエピトープ提示）という免疫学の基本を忘れてるんじゃないかと、常々思っています。 >免疫細胞に貪食され10アミノ酸前後に消化・断片化され、提示されたエピトープにたいして抗体が作られるのですから、この点に関して、界面活性剤があろうとなかろうと関係ないと思いますが。 抗体を作る際、ラボの先輩から「抗体は総じて5アミノ酸残基程度を認識する」と教わりました。この理解は一般に正しいのでしょうか？ つまりAPさんが仰るように10前後に断片化され、そのうちの特にエピトープとして優位な領域が選択される、つまり断片化領域＝抗体の認識配列では無い、という理解で良いのでしょうか？ それを踏まえて、もし、それら断片化の長さ、認識配列の長さに関して論じた原著なり総説なり御存知でしたら教えて頂けないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.954-11 - 2009/08/01 (土) 11:08:47 - AP 界面活性剤とタンパク質の結合は共有結合ではなく、静電気力や疎水結合力などで、希釈や拡散で容易にはずれるてしまいます。抗原注射液に調製されたあとや（普通、鉱物油とエマルジョンにするので、界面活性剤は油との親和性によって、タンパク質との相互作用も減力するでしょう）、注射されてから体内で起こる拡散、希釈や代謝エピトープに影響を与えるとは、化学の常識から考えてもありそうにないことでしょう。免疫の場面で、どこ段階で界面活性剤が外れるかというspecificなことについて言及している文献はないかもしれませんが、界面活性剤によって抗原性が変わると考える合理的な理由もまたないです。 不溶化したタンパク質や、界面活性剤や変性剤によって変性したタンパク質では、インタクトなタンパク質に対する抗体ができない、リフォールディングしてから免疫しなければならない、などど主張する人がいますが、抗原に対して、免疫系がどのようなプロセスで抗体を産生するのか（たとえば、抗原の貪食、断片化とエピトープ提示）という免疫学の基本を忘れてるんじゃないかと、常々思っています。

(無題) 削除/引用 No.954-10 - 2009/08/01 (土) 08:54:08 - c SDS^PAGEのクマシーゲルからバンドを切り出してそのゲルつぶしてアジュバンドなしで注射して、抗体作ってるひともいるし、注射すれば、含まれている界面活性剤もしだいに拡散して局所濃度は低下していくだろうからあまり心配しなくてもいいのではないでしょうか。エマルジョンが出来るまですこし時間かかることはあるかもしれないけど。

(無題) 削除/引用 No.954-9 - 2009/07/31 (金) 12:46:55 - う ＞免疫細胞に貪食され10アミノ酸前後に消化・断片化され、提示されたエピトープにたいして抗体が作られるのですから、 免疫細胞内に取り込まれる時、取り込まれた後、消化・断片化後、ペプチドになって提示された時 私は不勉強なので、SDSがいつまで結合しているのか知りません。 なので、影響があるか無いか、誰もわからないと言ってしまいました。 ＞この点に関して、界面活性剤があろうとなかろうと関係ないと思いますが。 そうなのですか？教えてください。

(無題) 削除/引用 No.954-8 - 2009/07/31 (金) 12:27:11 - AP よいエマルジョンが出来ないとは書きましたが、だから免疫できない、抗体出が出来ないということではないです。界面活性剤が入ってゆるいエマルジョンにしかならないことも良くありますが、それで抗体が出来なかったということは今までの経験ではないです。良い抗体ができるか出来ないか、やってみるまで分からないというのは界面活性剤を含まない抗原の場合とおなじです。 ただし、エマルジョンは固すぎず柔らかすぎずが免疫が良く付く、抗体価が上がりやすいということは昔から言われていることなので、同じタンパク質で、界面活性剤ありとなしがあるのなら、なしの方が良いと言うことは言えるでしょう。 可溶化のために界面活性剤を入れているとしても、抜いて不溶化したタンパク質をエマルジョンにしたほうが成績が良いくらいじゃないかと思います（少なくとも、そうやって抗体が出来なかったという経験もまたない）。 >系面活性剤は、タンパク質の立体構造に影響を及ぼすことは周知の通り。 >それが影響あるか無いか、誰にもわかりません。 タンパク質の高次構造に影響があっても、エピトープの構造には影響ないでしょう？　免疫細胞に貪食され10アミノ酸前後に消化・断片化され、提示されたエピトープにたいして抗体が作られるのですから、この点に関して、界面活性剤があろうとなかろうと関係ないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.954-6 - 2009/07/31 (金) 10:07:11 - う 抗体ができるか？ という質問であるのならば、 「やってみないとわからない」 これ以上の答えは無いと思われます。 系面活性剤は、タンパク質の立体構造に影響を及ぼすことは周知の通り。 それが影響あるか無いか、誰にもわかりません。

(無題) 削除/引用 No.954-5 - 2009/07/31 (金) 09:06:31 - DNAI おそらく問題ないと思います。 不溶化した精製タンパクに0.1％SDSを添加し免疫したところ、問題なく抗体価が上がりました。 ただ、抗原がSDS化されることによりその構造が変化し、抗体の使用用途が制限される可能性はあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.954-4 - 2009/07/31 (金) 01:27:40 - おお 物によっていろんな状態で免疫しているというのが 現状のようです。あまり気になされないで打つというのが 一つの方針のように思えます。 場合によってはウレアが入ってたり、SDSPAGEのゲルごと だったり、インクルージョンボディーをけんだくして、、 とか

(無題) 削除/引用 No.954-3 - 2009/07/30 (木) 23:59:00 - とりとん あるGST融合タンパク質を精製し、抗原として使おうとした際、完全に界面活性剤が無い場合には凝集して精製カラムにつまってしまったので、0.01%程度のTritonX100存在化で精製、アジュバンド作成、免疫した事が有ります。APさんが仰るように、通常より緩いアジュバンドになってしまいましたが、抗体自体はできましたよ。確率的には4羽中4羽で（抗原二種類、各二羽ずつ）できました。界面活性剤の濃度や種類にもよるのかも知れませんが、やはり主に問題になるのは抗原（部位）そのものかと思っています。 勿論、同一抗原で界面活性剤有無の比較はしてません。 参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.954-2 - 2009/07/30 (木) 21:27:21 - AP 界面活性剤が抗原性を変えるということはないとおもいますが、アジュバントと混ぜても、教科書どおりの適当な硬さをもったクリーム状にならないでしょう。さらさらゆるく乳化します。

抗原性 削除/引用 No.954-1 - 2009/07/30 (木) 20:57:08 - なおちゃん 界面活性剤での透析で得られた精製タンパクを免疫抗原として使用する場合、透析buffer内の界面活性剤が大きく影響することはあるのでしょうか。 どなたか知恵を貸していただけたら幸いです。

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