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(無題) 削除/引用 No.943-18 - 2009/07/29 (水) 23:24:13 - T４ 遅くなって申し訳ありません。 月詠さん、懇切丁寧な説明をしていただき、大変参考になりました。ありがとうございました。 cDNAさん、質問しておいて遅くなって申し訳ございませんでした。菌成分の同定まではまだ行っていません。そのようなアウトプットがあるんですね。参考にさせていただきます。ありがとうございました。 留学中に使ったようなさん、ありがとうございます。 ガンマ線で滅菌すると、活性を失ってしまいそうな気がするのですが...。

(無題) 削除/引用 No.943-17 - 2009/07/29 (水) 17:34:19 - 留学中に使ったような ガンマ線とか？ 使える線源がもし有ればだけど

(無題) 削除/引用 No.943-16 - 2009/07/29 (水) 12:56:01 - cDNA どの菌成分をどういうアウトプットでみるのですか？ 菌成分センサーは「たくさん」ありますから、どの成分とセンサーの組み合わせを観察するかです。 アウトプットもサイトカイン産生、リン酸化、Lucなどたくさんあると思いますが。。。

(無題) 削除/引用 No.943-15 - 2009/07/29 (水) 12:54:19 - cDNA どの菌成分をどういうアウトプットでみるのですか？ 菌成分センサーはありますから、どの成分とセンサーの組み合わせを観察するかです。 アウトプットもサイトカイン産生、リン酸化、Lucなどたくさんあると思いますが。。。 >[Re:7] T４さんは書きました : > 菌による上皮細胞への影響ではなく、菌体成分の上皮細胞への影響を見たいのですが、何かいい案があれば教えていただけないでしょうか？よろしくお願い致します。

入れ違いで「済」になってしまいましたが補足です 削除/引用 No.943-14 - 2009/07/29 (水) 12:38:48 - 月詠 加熱処理後も生存している菌が残存しているか否かは、調整した死菌液の一部を、平板培地に接種して、コロニーが形成されるかどうか観察するだけで検証できますよね（少なくともコロニー形成能が失われているか否かは）。 それに、たとえ殺菌処理が完璧でなかったとしても、たとえば、10^9CFU相当の死菌体の中に、10^3〜10^4 CFU程度の生菌が残存していた（殺菌率 10^-6〜10^-5）としても、ウェルに死菌を10^7 CFU/well相当の濃度で添加するなら、そこに添加される生菌も10^1〜10^2 CFU/well程度になるわけですから、感受性のある抗生物質で増殖を抑えておけば実験結果に致命的な影響があるとは思えません。

詳しい実験系が不明ですが・・・ 削除/引用 No.943-13 - 2009/07/29 (水) 12:15:30 - 月詠 滅菌PBS(-)で調整すれば十分だと思います。 PBS(-)だけ先にオートクレーブ滅菌しておいて、 乾燥死菌粉末（乳酸菌以外は混入していないはず？）を溶かせば、 調整中に空気中の雑菌が混入しない限り問題ありません。 万一、調整中に雑菌が混入したとしても、 （イ）量的に微量 （ロ）調整した高濃度の加熱死菌液から段階希釈により濃度系列をつくり、 　　　さらにその極微量だけを培養系に添加する 　　　→すべてのウェルに混入した雑菌が添加されてしまう確率はほぼゼロ （ハ）培養液に適当な抗生物質を添加する 　　　→（耐性菌でない限り）少なくとも結果を検定する２〜３日後 　　　　までは増殖しない ことを考えれば、実験結果にはほぼ影響を与えないはずです。 また、雑菌の混入はランダム要素ですので、 （ニ）複数のウェルの平均を取る際に、著しく外れた値を示すウェルは除外 （ホ）実験を複数回試行しても再現されない のですから、誤った結論を導くこともないはずです。 それから、この手のin vitro実験は、とにかく現実にはありえないくらいの菌量で刺激してようやく結果を出しておられる論文をしばしば目にしますが、乳酸菌死菌でなくとも、異物が多量に存在すれば宿主の腸管上皮細胞は何らかの応答をしても不思議ではありません。 ですので、 （１）細胞系に添加する菌量を常識的な範囲にすることと、 （２）実験群である乳酸菌死菌体（成分）の腸管上皮細胞に対する活性が、 　　　その乳酸菌で特に強いことを示すための陰性対照群 が必要になると思います。 また、死菌を調整する方法も、加熱だけでなく複数の方法を検討された方がよいと思います。 グラム陽性菌ですので、加熱しても、乳酸菌細胞壁中のペプチドグリカンの構造は損なわれないと思いますが、当然、リポタンパクや細胞侵入因子などのタンパク性成分は失活ないし変性してしまうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.943-12 - 2009/07/29 (水) 11:51:50 - T４ うさん、ありがとうございます。返事が行き違いになってしまって申し訳ありません。 そうですね。菌が加熱処理でほとんど死んでいそうですし、深く考え過ぎていたのかもしれません。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.943-11 - 2009/07/29 (水) 11:44:20 - T４ うさん、お返事ありがとうざいます。 無菌外のものを滅菌せず、無菌状態のインキュベーターで使用することがまずいのではないかと考えてしまいました。 基礎的なことが分かっていないのかもしれませんが、大丈夫なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.943-10 - 2009/07/29 (水) 11:37:39 - う ＞無菌外で重量を測定した乳酸菌 クリーンベンチ内で測ればいいのでは？ 70％アルコールできれいに拭いた秤でも、クリーンベンチに入れればいいのでは？ 秤を絶対にクリーンベンチ内に入れちゃダメっていうこだわりがあるのであればやりようが無いですが。 培養するのには問題ないでしょう。培地とかも外からクリーンベンチ内に入れるでしょうから。 100℃、30分処理でほとんどの菌は死んでいるのでは？ これ以上はやってみないとわからないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.943-9 - 2009/07/29 (水) 11:31:16 - う 何が問題で、何を難しく考えているのかよくわかりません。 「100℃、30分処理で死菌体にしたもの」を そのままクリーンベンチに持ち込み、 滅菌されたPBSを、クリーンベンチに持ち込み、 クリーンベンチ内で２つを混ぜて、そのまま細胞に添加 すればいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.943-8 - 2009/07/29 (水) 11:23:50 - T４ TSさん、お返事ありがとうございます。 ＞作用させる時間はどのくらいでしょうか？ 数時間だったら、できるだけきれいに扱って、滅菌せずに使うのが正解だと思います。 オートクレーブとかは、なにが活性を失うかもわかりませんから、だめだと思います。 数日間（2,3日）は作用させたいと考えております。いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.943-7 - 2009/07/29 (水) 11:19:00 - T４ cDNAさん、ありがとうございます。 ＞上皮細胞が菌にどう反応するかみたいのなら、加熱、化学処理はやめた方が良いですよ。 菌による上皮細胞への影響ではなく、菌体成分の上皮細胞への影響を見たいのですが、何かいい案があれば教えていただけないでしょうか？よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.943-6 - 2009/07/29 (水) 11:13:52 - TS 作用させる時間はどのくらいでしょうか？ 数時間だったら、できるだけきれいに扱って、滅菌せずに使うのが正解だと思います。 オートクレーブとかは、なにが活性を失うかもわかりませんから、だめだと思います。

(無題) 削除/引用 No.943-5 - 2009/07/29 (水) 10:52:47 - cDNA 上皮細胞が菌にどう反応するかみたいのなら、加熱、化学処理はやめた方が良いですよ。

(無題) 削除/引用 No.943-4 - 2009/07/29 (水) 10:46:18 - T４ 早速のお返事ありがとうございます。 <オートクレーブじゃない？ 100℃、30分処理で死菌体にしたものを使用しております。私の研究室では180℃でオートクレーブにかけるので、何か変化してしまうのではないかと不安です。 <空の容器の重さを量っておいて、無菌操作で試薬を入れて、試薬込みの容器の重さを量れば．．． 試薬というのは乳酸菌の死菌体ということですか？

(無題) 削除/引用 No.943-3 - 2009/07/29 (水) 09:32:01 - ザンギ 空の容器の重さを量っておいて、無菌操作で試薬を入れて、試薬込みの容器の 重さを量れば．．．

(無題) 削除/引用 No.943-2 - 2009/07/29 (水) 09:15:58 - qq オートクレーブじゃない？

無菌状態 削除/引用 No.943-1 - 2009/07/29 (水) 05:59:03 - T４ 細胞培養初心者のものです。 腸管上皮細胞に乳酸菌の死菌体を添加しようと考えています。 乾燥死菌体の乳酸菌を1×PBSに溶かしてから添加という形をとりたいのですが、無菌室で行う際、フィルター滅菌をしたら乳酸菌がフィルターに引っ掛かってしまいます。無菌室のインキュベーターで乳酸菌添加を行う場合、無菌外で重量を測定した乳酸菌をそのまま無菌のPBSに溶かしただけで無菌室のインキュベーターで添加実験を行うことに問題はないでしょうか？ 本当に基礎的なことかもしれませんが、よろしくおねがいいたします。

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