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(無題) 削除/引用 No.938-14 - 2009/07/30 (木) 08:58:29 - 千夏 >うさん ご丁寧な回答ありがとうございました！ また機会があればご教授お願いいたします！！m(_ _)m

(無題) 削除/引用 No.938-13 - 2009/07/30 (木) 07:19:35 - CJ 抱埋と固定がごっちゃになっているような気がします。 ワックスとか凍結は固定技法ではなくて、切片作成法ですよ。 組織は潅流固定してありますか？ また、「染まっているか染まってないような」とか言う状態だと、そもそもシグナルがアーチファクトである可能性すらあります。コントロールは取っていますか？ それらをクリアしたうえで、 数を数えるということですが、いろんな流儀があると思うのですが、暴露/非暴露の標本を同時に染色、同時にＤＡＢなり何なりで発色し、ランダムサンプリングで写真を撮り、ImageJなどで適切な閾値を設定して閾値より上のシグナルを持つ細胞をカウントする、とかが良いのでは？ あと、どうも暴露/非暴露で精巣サイズが変わっているのなら、細胞密度が変わってもおかしくありません。ＨＥ染色か何かで1視野あたりの細胞数を数えてそれでデータを正規化する必要があるかもしれません。

ありがとう２ 削除/引用 No.938-12 - 2009/07/30 (木) 06:44:24 - ta+ta+re 組織さん、うさん、千夏さん、CJさんお返事ありがとうございます。 孤独に何カ月もうじうじしていたのがうそのようです。少し感激です。これで実験もちょっと前向きに楽しく取り組めそうです。 組織さん、いっぱいアドバイスありがとうございます。固定はポリエステルワックス固定と、凍結固定をしたのですが、凍結固定はぼろぼろ、ポリエステルワックス固定は暴露前のはまあまあきれいにでき、暴露後のは、精巣自身もかなり小さくなり、なかの組織ももろく、精細胞自身もspermatogonia 以降の細胞増殖もあまりないんですよね。でもおっしゃるように、少し厚めにきりなおすか、カウント方法を一定細胞でカウントするとか、ちょっと工夫してみようと思います。今持ってる文献では、濃いとか薄いとかで＋　＋＋とかで評価してあるんですが、そんなのじゃなくて、定量は無理にしてももっと、ちょっと具体化して暴露後は、陽性細胞が減ったんだぞ〜という感じの何かない？とうちのBOSSがのたまうのです。一定細胞でカウントするとかがありなら、ちょっといいかもしれません。そんな文献御存じの方教えていただきますと幸いです。 　 うさん そ、そ、そうなんですよね。おっしゃるとおり。染まる、染まらないで判定できればいいんですが、実際、spermatogoniaに染まるといわれている抗体ではありますが、spermatogoniaのみというわけではなく、spermやlydigにも染まるといわれ、しかも、いわれている、という段階なので。。。暴露後のも染まってるといわれれば染まってるような〜て感じで。染まり具合もそう単純にひかくしていいのかな〜　なんて思ってて。うさんにいわれてほっとしました。 それで、暴露後減ったど〜と論文でいうにはどうしたら。。って感じなんです。 CJさん はい。固定法や薄切法をいろいろやってみます。ありがとうございます。 みなさんに、話してると自分でも自分で分からないところが少し見えてきました。また、疑問点を質問させて頂きます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.938-11 - 2009/07/29 (水) 21:21:20 - CJ 形態の仕事をやりたいのでしたら、精巣をきれいに切る、というところをクリアしておくのは重要でしょうね。薄切法をいろいろ工夫してみる余地がありそうです。

(無題) 削除/引用 No.938-10 - 2009/07/29 (水) 18:06:41 - う はっきり言って、１度やってみて 処理前は100人中100人が「染まらない（１つも）」、 処理後は100人中100人が「こりゃ完全に染まってる」 という結果になるのであれば、質問しなくても、定量性がなくても 3)よって、用いた抗体が認識する抗原の量は薬剤処理によって増加している。 こう結論づければいい。 もし、 処理前は「染まる」 処理後も「染まる」 印象として後の方が「濃いような気がする」 という結果であれば、 3)よって、用いた抗体が認識する抗原の量は薬剤処理によって増加している と結論づけることはかなり難しい。 処理前の組織中の細胞の１つ１つの染まり具合 と 処理後の組織中の細胞の１つ１つの染まり具合 その薄さ濃さを比較することが難しい １つ１つの細胞の染まり具合のばらつきを考察する方法があるのか？難しい （どうやって比較するのかということ） だが、目的によっては免疫染色は、その目的を表すのに強力名ツールであることは間違いない だから、「目的は？」と聞いたまで。 ウエスタンブロットの結果を補佐する結果がほしいという目的だったら、 そのためにする免疫染色の表現の方法はあるといった感じに。

(無題) 削除/引用 No.938-9 - 2009/07/29 (水) 17:52:01 - う 1)薬剤処理ありの組織を染色＞spermatogoniaが濃く染色される 2)薬剤処理なしの組織を染色＞spermatogoniaが染色されない 免疫染色（非蛍光）において、濃い薄いという判断がその仕組みから難しいので、 （そもそも、質問者様も「定量性のない手法である」という認識を持っている） もともとあるタンパク質「薄い」とup-regulateされて発現が多くなる「濃い」 この「薄い」「濃い」は微妙な差である場合、判断が難しいということ。 「真実の発現量」が微妙でなくとも（つまり本当ははっきりとした違いがあるかもしれないが） 組織を扱う人であれば、同組織内でも固定のされ具合によってシグナルが所々違う場合があること、 組織切片の操作によって同切片内でも微妙にシグナルが異なること、 などなど、注意すべきところが多すぎて１）２）は「理想」であるので むずかしいということ。 しかも、処理前後の組織の状態があまりにも違うことを加味すると・・・。 有り無しがはっきりわかるほどのものであるというのであれば （もともとは全く見えない、up-regulateされると真っ黒） こんなところで質問する必要がない問題だから、質問するわけが無いという 先入観をもった私が愚かか。

(無題) 削除/引用 No.938-8 - 2009/07/29 (水) 16:59:59 - 千夏 >うさん 1)薬剤処理ありの組織を染色＞spermatogoniaが濃く染色される 2)薬剤処理なしの組織を染色＞spermatogoniaが染色されない 3)よって、用いた抗体が認識する抗原の量は薬剤処理によって増加している。 上記証明方法になんら違和感を感じないのですが、免疫組織染色にてタンパク質の発現量の比較をすることが無理だという理由はなんなんでしょうか？ >tatareさん 組織からタンパク質を抽出してwestern blotをすれば免疫染色の結果とあわせて特定蛋白質の量について言及することが可能だと思いますよ！

(無題) 削除/引用 No.938-7 - 2009/07/29 (水) 11:59:11 - う どう比較するという前に、目的がわかりません。 ある薬剤に暴露された後と前での「何を」比較しようとしているのか、 なぜ免疫染色をしようとしているのか、 さっぱりわかりません。 この免疫染色だったら、 ゴニアの数を比較したいので、ゴニアのマーカーで染めてその数を比較する。 これしかできないと思いますが。 他に何を比較しようと考えているのかわかりません。 もしかして、 暴露後、ゴニアにおいて、そのタンパク質の発現量の違いを見ようとしているのですか？ それは無理でしょう。

(無題) 削除/引用 No.938-6 - 2009/07/29 (水) 09:27:25 - 組織 >testisひとつ分がきれいに形が形成されません ここを見逃してました。これは、そもそも精巣全体の組織構造が異常と言うことでしょうか？もしそうであれば、精細管単位で評価するのは難しいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.938-5 - 2009/07/29 (水) 09:18:16 - 組織 >その抗体は、おそらくspermatogoniaに陽性となると思われます。 こういうケースでは、1つの精細管あたりの陽性細胞数で評価してやるのが一般的かなと思います。組織がもろいとのことですが、少し厚めに切るなどして安定した切片で染色すれば、精細管レベルなら十分区別できるでしょう。また文献を調べれば、精巣で免疫組織学的の評価をしているものがたくさんあるでしょうから、それらを参考にされてはいかがでしょうか。

ありがとう 削除/引用 No.938-4 - 2009/07/29 (水) 08:01:57 - ta ta re 組織さん、よっしーさん、お返事ありがとうございます。 　ある薬剤に暴露された後と前での比較です。その抗体は、おそらくspermatogoniaに陽性となると思われます。が暴露された方は、組織がもろく、切片にしたときにtestisひとつ分がきれいに形が形成されません。なので、おっしゃるように一定細胞数あたり、というのがいいのかもしれませんね。もし、何か参考文献など御存じでしたら教えていただくと幸いです。 　うちの研究室は、各個人がそれぞれ別の実験をしているので、誰にも相談相手がいず、７年ほど同じ実験で一人悩んでおりました。本当にお返事うれしいです。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.938-3 - 2009/07/28 (火) 14:04:29 - 組織 顕微鏡で観察した時にどんな差がありますか？ それによってデータの提示法もある程度決まってくると思います。 他の方も言われているように、単位面積あたりの陽性細胞数、あるいは一定細胞あたりの陽性細胞率が一般的じゃないでしょうか。 目で見て明らかな差があるのであれば、2つの写真を並べて示すだけでも十分な場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.938-2 - 2009/07/28 (火) 13:52:05 - よっしー 何を比較したいのか良くわかりませんが， 陽性細胞の数，あるいは比率じゃないでしょうか

免疫染色の比較 削除/引用 No.938-1 - 2009/07/28 (火) 13:36:57 - ta ta re 私は，実験論文作成するのははじめてなので教えてください．ふたつの免疫染色標本（非蛍光）を比較するするのですが，定量性のない手法であると聞きました．その場合，どうやって比較するのですか？染色の濃さですか？染色された量ですか？ちなみに検体はマウス精巣です．初歩的ですみません．

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