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(無題) 削除/引用 No.937-5 - 2009/08/18 (火) 20:52:02 - ｓｈRNA short hairpinは不安定性があるようで、どのステップで変異が入るのか明らかではないですが、GC-richな配列で強いステム構造を取る配列では変異が入りやすいと言われています。その解決策として、shのセンス鎖に人為的に変異を入れてオリゴをデザインする方法があります（J Gene Med 6:715, 2004)。センス鎖の2-4塩基位のCをTに変えてデザインするだけです（アンチセンス鎖は絶対に変えてはいけません）、RNAi効率を落とさず安定性が増し、シークエンスも容易に行えます。他の方法でうまくいかなかった時は一度試してみられるとよいかもしれません。注意としては、変異導入によって、Tが4つ以上続く配列にならないようにします(ストップコドンになる）。

(無題) 削除/引用 No.937-2 - 2009/07/28 (火) 22:28:03 - ドド emanonさま 私もVectorは異なりますがpENTR/H1/TOにて同じ様な症状に出会いました。解決策としては、hostの大腸菌をTOP10からDH5αに変更し構築しました。また、私の場合single point mutationだったので、PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kitを使用してそのまま大腸菌に形質転換を行いました。まずはHostを変更してみることをお勧めします。

pENTR/U6 vector　システム 削除/引用 No.937-1 - 2009/07/28 (火) 12:12:06 - emanon 現在、InvitrogenのGatewayシステムを用いて、vectorを用いたRNAiを行おうとしています。 以前の方（http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=642）と同様、 shRNAをコードしたオリゴを作成し（oligoはPAGEでのpurificationをしています）、pENTR/U6 vectorに組み込みました。 Colony PCRでinsertの存在を確認後、シークエンスをしました。 しかしすべてのクローンで全く別個のmutationが入っていました（single point mutation, double mutations, deletion, etc）。 シークエンスは特別な処理をしなくてもvectorから直接読めたので、以前のレスにもあったように「変異入り」であったのかも知れません。 マニュアルには「原因は分からないが（多分 E.coliによる修復機能）、10−20%にmutationの入る可能性があるので、シークエンスが望ましい」とあったのですが、予想以上の変異に驚き、次の方策を迷っています。 clone数を増やしてシークエンスを繰り返しpositive cloneを見つける、など、御教授頂けましたら幸いです。 よろしくお願いいたします。

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