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(無題) 削除/引用 No.927-11 - 2009/07/31 (金) 12:08:26 - おお >[Re:10] おおさんは書きました : > > 最近関連したとピが上がってましたので > こちらを参考にされてはどうでしょうか。 > http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=925 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=933 リンク張り忘れていたようです.

(無題) 削除/引用 No.927-10 - 2009/07/31 (金) 01:16:28 - おお >[Re:9] よしさんは書きました : > 検出感度の高いキットなんですが、現在ECLを使用しているのですが、ECL Plusなどを使用してみるといいのでしょうか？バックグラウンドがこくなるからあまり良くないとか聞いたのですが、実際そういうものを使用したほうがよいのでしょうか？ 最近関連したとピが上がってましたので こちらを参考にされてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.927-9 - 2009/07/30 (木) 21:12:07 - よし 検出感度の高いキットなんですが、現在ECLを使用しているのですが、ECL Plusなどを使用してみるといいのでしょうか？バックグラウンドがこくなるからあまり良くないとか聞いたのですが、実際そういうものを使用したほうがよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.927-8 - 2009/07/28 (火) 11:15:28 - おお 5ugで4倍量なら60ugですよね。システムにもよりますがオーバーロードに なってしまってかえって感度を落とすことはよくあります。 随分昔にバンドがいまいち薄い時はどうしますかというアンケート をここで取ったことがあります。 選択肢として、 のせる量をふやす(そのままの状態あるいは コームを太くしたりゲルを厚くして) 検出かんどの高い検出キットをつかうなど を書いていましたが、回答数がそんない多くないので なんともいえませんが、 検出感度のたかいきっとを使うというのがまあ妥当か とおもえました。 バンドをシャープにすると薄くてもクリアーな線になりますので そういうところも考慮しても良いかと思います。 トランスファー、分解能の影響があまりでない程度に ゲルの濃度を上げるとか、私は個人的にはゲルのバッファーの 濃度を上げてやっています。 TRISーTRICINEのシステムもいいかもしれません。 ただ、タンパクの性質上シャープにならずにスメアーなもの もありますけど、そういうものでも全体のえいどうが シャープであれば検出感度は上がると思います。 あとウエスタンのトランスファーとか条件がベストか検討したことが なければ少しチェックだけでもしてみた方がいいかもしれません。 単に薄くてバックに問題がないなら抗体の濃度をあげるのが 手っ取り早いかもしれませんね。 検出キットにもよりますが一晩放置というのも結構私はやります。 キット的にはまあ1時間位で殆ど光らなくなるようなものが多いですが、 最後の1フォトンまで搾り取ってやろうという魂胆です。 ま、バックもそれなりに上がってきますから抗体の濃度 (特に2次抗体)はそれに対応できる濃度を知っておく必要が あるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.927-7 - 2009/07/28 (火) 11:08:33 - ~ >タンパクの存在量が少ないということなのでしょうか？ 抗体がだめな抗体だというのも捨てがたいと思います。 IPできる抗体であり、手元にビーズなどが揃っていれば、IPを試すのが解決への近道のような気がします。 ケミルミであれば、 感度が高いと宣伝されている試薬を試してみたり、 高感度フィルムを試してみたり、 1時間くらいはさんでみたりしてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.927-6 - 2009/07/28 (火) 09:42:05 - よし 一回サンプル量を2・3・4倍量でふってみたら、4倍量で差がわかるぐらいのバンドがみえたのですが（それでもまだ薄いです）、これはタンパクの存在量が少ないということなのでしょうか？そうか他にも指摘されたようにまだ条件をかえてしたほうがよいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.927-5 - 2009/07/27 (月) 22:34:45 - 名無し WBは非常に高感度なので、それでみえないということは、存在量が極めて低いか、あるいは不安定で分解されやすいか、何かの刺激がないとほとんど誘導されないか、ゲルに入りにくいとか、転写されにくい、とかそういうことではないかと思います。対策として、(1)ラフに核と細胞質（post nuclear sup)に分けてそれぞれ調べてみる。一種の濃縮になり相対的な存在量が増すので。(2)不安定な蛋白質かもしれないので、極力低温を維持して、かつプロテアーゼ阻害剤を入れるなどして、分解を抑える。(3)IPして濃縮する。(4)大まかなpIや分子量を考えて必要なら転写条件やゲル濃度を変えてみる、などがあります。

(無題) 削除/引用 No.927-4 - 2009/07/27 (月) 22:09:19 - ふる 初めて使う抗体なら、抗体濃度を振ってみる、処理時間を振ってみる、現像時間を振ってみる、とまずは条件検討からされたら如何でしょうか？ 振る間隔は、2倍-5倍で適当に。 もし、他の実験で既に抗体の条件を決めていて、タンパク質濃度が薄いということであれば、タンパク質溶液を濃縮してみてはどうでしょうか？ 勘所が分からない場合は、納得できる条件を探してから本番の実験に入ったほうが良いと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.927-3 - 2009/07/27 (月) 22:00:23 - よし すみません検出のつもりが犬種になってました。抗体の量を増やせばいいということですか？現在1:1000の割合で使用しているのですがどれくらい増やすのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.927-2 - 2009/07/27 (月) 19:10:09 - ? 犬種?犬のタンパク質？ ＞検出しにくいようなタンパクでは一晩現像したりとかするのでしょうか。 真っ黒になると思う むしろ抗体をo/nした方がいいのでは？

タンパク量と犬種 削除/引用 No.927-1 - 2009/07/27 (月) 11:04:13 - よし westurn でタンパクの検出なんですが、現在15μg/wellで流しているのですが、目的のタンパクがうすいようなので、単純に流す量を増やせばもっとはっきり検出できるのでしょうか。また、どれくらい増やすなどは、いくつかの濃度で流してみていくしかないのでしょうか？それと現像時間なんですが、検出しにくいようなタンパクでは一晩現像したりとかするのでしょうか。

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