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(無題) 削除/引用 No.925-23 - 2009/09/29 (火) 18:48:36 - 名無し この問題って、もう解決しましたか？ 原因分かりました？

(無題) 削除/引用 No.925-22 - 2009/07/28 (火) 02:48:27 - おお >[Re:13] あべちゃんさんは書きました : > HRPでほっとんどしぐなるが得られなかった失敗。 > > ぼくは、アザイド入りブロック剤を使ったこと位です。 アザイドは確かにうっかりということはありそうですが、 今回はそうでないです。

(無題) 削除/引用 No.925-21 - 2009/07/28 (火) 02:43:19 - おお >[Re:20] おおさんは書きました : > >[Re:19] 笑い男さんは書きました : > > >[Re:16] おおさんは書きました : > 培養細胞のライセートでネイティブな条件でウエスタンしたことが > ありますが、 これちょっとあいまいですね、、、 ネイティブな条件ででんきえいどうして、 ウエスタンということです。

(無題) 削除/引用 No.925-20 - 2009/07/28 (火) 02:30:21 - おお >[Re:19] 笑い男さんは書きました : > >[Re:16] おおさんは書きました : > 　質問としては、鉄以外の金属を含むタンパク質でも（活性中心に亜鉛持ってるとか）、発光することはありえるのか？ということです。それらしい現象を経験したことあるとか（確証まで求めていません。可能性の話で結構です）なんかしらコメントを頂きたいです。 培養細胞のライセートでネイティブな条件でウエスタンしたことが ありますが、ノンスペが出てこまったということはなかったですね。 ヘムであればタンパク出なくてポルフィリンに鉄が配位してますが、 そのほかのタンパクはタンパクのアミノ酸が金属を保有していることが 多いですしメタノール(や場合によってはSDS)を含んだトランスファーバッファーで変性してしまえばかなり金属が抜けてしまうのではと思ったりもします。ん逆にリネーチャーさせて、検出なんんていけるかな? あと私はひとりたぶんレスできるひとをしってます。 "あべちゃんさん"はたしかミトコンドリアを使って ブルーネイティブとかしたりしてますよね。 それでウエスタンされたことありますでしょうか? ミトコンドリアだと酸化還元酵素が豊富なので 鉄硫黄中心をもつタンパクとか、あ、ヘムタンパクも ありますよね。 、、、、と思い切り振ってみる。

(無題) 削除/引用 No.925-19 - 2009/07/28 (火) 01:53:55 - 笑い男 >[Re:16] おおさんは書きました : > やはりシグナルが強い試薬を使う時は抗体の濃度を下げますね。 > とくに2次抗体。 > > そうすることで、ノンスペとスペシフィックの特異性(しんわせい) > の違いが効果的に出せる濃度まで下げれるというのがまずありますね。 　同意します。２次抗体濃度を下げて、十二分に特異性を引き出して、そして高感度発光試薬でS/Nを改善する〜といのが私の中の落とし所になると思います。 　もう少し話題を伸ばしますが（よりマニアックになるので返答が付くのか怖いところですが）、ＥＣＬか何かのトラブルシューティングで、ヘムタンパクがバックの原因になることが記載されています（これが反応するからこそ、コナン君は血痕を見つけて事件を解決するのですが）。 　質問としては、鉄以外の金属を含むタンパク質でも（活性中心に亜鉛持ってるとか）、発光することはありえるのか？ということです。それらしい現象を経験したことあるとか（確証まで求めていません。可能性の話で結構です）なんかしらコメントを頂きたいです。

(無題) 削除/引用 No.925-18 - 2009/07/28 (火) 00:05:58 - み >[Re:15] 笑い男さんは書きました : > >[Re:7] みさんは書きました : > > ECLplusは確かにECLより5-10倍シグナル強いけどバックも高めなので変えたいと思っています。 > > 　ECL PlusでＳがupするけどＮもupしているということは、S/Nを考えるとＥＣＬとＥＣＬ Plusでそんなに差はないといことですね。微量のtargetでも検出できるという意味でPlusの存在意義は納得できますが。 > > 　Ｎの原因って何がありますか？ノンスペのＰＯＤがＮの原因だとすれば、それはブロッキングとか、処理抗体の濃度とかで左右されますよねー。ノンスペＰＯＤを化学発光試薬で制御できるのでしょうか？ > > 　えーーーーーーS/Nというものが解らなくなってしまいました。 経験的にECLで検出してうすーいバンドが得られた時は１回washしてECLplusで検出します。すると５−１０倍の濃いバンドになります。しかしバックグラウンドも出てくるのでそれ以上バンドを濃くするための長焼きは意味がないくらいです。持続時間もせいぜい20−30min-maxのような・・・。 ブロッキングは全て5%non-fat milkで抗体濃度はECLで検出できる濃度で適用しているのでノイズが高く出るのかなあ。ECLplusでいきなり検出するのなら抗体濃度を下げると良いのだろうと想像します。 thermoシリーズのサイトを見ているとシグナルを強くする（っというよりは弱めないと言った方が良いのかな）ブロッキング試薬も販売されているようでチョット気になります。もしかしたらノイズも下げられるのかな。

(無題) 削除/引用 No.925-17 - 2009/07/27 (月) 23:44:15 - A >> あと、Thermoのsupersignalのピコ、デュラ、フェムトはECLよりお薦めで>すよ。シグナルが強いし、SN比も全然高いです。 >うーん使ってみたいと思うんですけどねぇ、、、、 >賞味期限の方はECLPLUSと比べてどうでしょうか、、、 私もcDNAThermoのsupersignalのピコを使うようになってECLをやめたくちです。 使い始めてからどれぐらいの期間保存できるかですが、最近うちのラボで は半年ぐらいのサイクルで新しいロットになっていると思います。ただ以前はもう少し長く(1年ぐらい？)保存していても大丈夫だったと思います。 あとマニュアルに書いてありますが溶液がまだ大丈夫かどうか怪しい場合、 まず少量の2つの液を混ぜて更に暗室でHRPの付いた抗体を加えると肉眼で 確認できる光を発しますからそれでわかります。

(無題) 削除/引用 No.925-16 - 2009/07/27 (月) 23:40:50 - おお >[Re:15] 笑い男さんは書きました : > >[Re:2] cDNAさんは書きました : > > あと、Thermoのsupersignalのピコ、デュラ、フェムトはECLよりお薦めですよ。シグナルが強いし、SN比も全然高いです。 > > 　S/Nが良くなるのは・・・なんで？　 > Ｓがupするの？Ｎがdownするの？両方なの？ たしかに同じレベルのシグナルの強さが得られる キットの間でS/Nが変わるというのは納得のいく説明が 見つからないですね。経験的にそうであるとおっしゃるなら 説明を求めるのはどうかとは思いますが、、、 わたしも気になるところであります。 やはりシグナルが強い試薬を使う時は抗体の濃度を下げますね。 とくに2次抗体。 そうすることで、ノンスペとスペシフィックの特異性(しんわせい) の違いが効果的に出せる濃度まで下げれるというのがまずありますね。 ですからECLとECLPLUSをくらべるとHRP存在下での発光強度と持続時間 は無茶苦茶さがあったと思いますが、結局S/Nをコントロールしたうえでの プラクティカルな検出感度はそこまで上がらないというのが本当の ところではないでしょうか。

S/N　話題の方向を変えちゃいますが 削除/引用 No.925-15 - 2009/07/27 (月) 23:22:19 - 笑い男 >[Re:2] cDNAさんは書きました : > あと、Thermoのsupersignalのピコ、デュラ、フェムトはECLよりお薦めですよ。シグナルが強いし、SN比も全然高いです。 　S/Nが良くなるのは・・・なんで？　 Ｓがupするの？Ｎがdownするの？両方なの？ >[Re:7] みさんは書きました : > ECLplusは確かにECLより5-10倍シグナル強いけどバックも高めなので変えたいと思っています。 　ECL PlusでＳがupするけどＮもupしているということは、S/Nを考えるとＥＣＬとＥＣＬ Plusでそんなに差はないといことですね。微量のtargetでも検出できるという意味でPlusの存在意義は納得できますが。 　Ｎの原因って何がありますか？ノンスペのＰＯＤがＮの原因だとすれば、それはブロッキングとか、処理抗体の濃度とかで左右されますよねー。ノンスペＰＯＤを化学発光試薬で制御できるのでしょうか？ 　えーーーーーーS/Nというものが解らなくなってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.925-14 - 2009/07/27 (月) 22:46:29 - ecowan そうならないように、Dr.Westernを必ずマーカーとして用いていて、少なくとも2次抗体以降はうまく行ってることを確認しています。抗体のシグナルはこれと比較することができるので。

(無題) 削除/引用 No.925-13 - 2009/07/27 (月) 13:30:06 - あべちゃん HRPでほっとんどしぐなるが得られなかった失敗。 ぼくは、アザイド入りブロック剤を使ったこと位です。

(無題) 削除/引用 No.925-12 - 2009/07/27 (月) 13:09:10 - み >[Re:11] cDNAさんは書きました : > ECLplus<デュラ＜フェムトだと思いますが > > ECLplus<ピコは微妙です。比べたことがありません。 ありがとうございます。ピコとデュラに挑戦してみます。

(無題) 削除/引用 No.925-11 - 2009/07/27 (月) 11:45:12 - cDNA ECLplus<デュラ＜フェムトだと思いますが ECLplus<ピコは微妙です。比べたことがありません。

(無題) 削除/引用 No.925-10 - 2009/07/27 (月) 10:57:56 - み >[Re:9] cDNAさんは書きました : > 3つともプロトコールはECLと全く同じで、1液と2液を混ぜて、washの終わったメンブレンにかけてラップして露光です。ピコ＜デュラ＜フェムトの順にシグナルが5倍か10倍（大体）強いです。 ご回答ありがとうございます。最後に、 ECL<ECLplus<ピコ<デュラ＜フェムト ですか？

(無題) 削除/引用 No.925-9 - 2009/07/27 (月) 09:55:43 - cDNA 3つともプロトコールはECLと全く同じで、1液と2液を混ぜて、washの終わったメンブレンにかけてラップして露光です。ピコ＜デュラ＜フェムトの順にシグナルが5倍か10倍（大体）強いです。 まずピコで5分くらいまで露光してみて、バンドが薄かったり見えなかったら、水でメンブレンを洗ってデュラをかけて露光、まだ見えなかったら、また水で洗ってフェムト、という風にやってます。 ピアスの回し者みたいですが。。。（笑） >thermoのフェムト、ピコ、デュラってどれが一番使い勝手良くてシグナルの出し方が汎用的ですか？ 要するにそれら専用のblockingやwashing bufferが必要でなく一般的なprotocolで最後の検出だけ変えれば良いのはどれですか？ バックグラウンドが低く、普通のECLより良いものは？ ECLplusは確かにECLより5-10倍シグナル強いけどバックも高めなので変えたいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.925-8 - 2009/07/27 (月) 09:45:33 - おお >[Re:5] Rさんは書きました : > 現像液がだめになっているときがありましたが、どうでしょう。 うーん機械で現像していて、機械は定期的にメンテ、液の補充を していますので、、、、 それで現像液のせいなら、、やはり運が悪い。 ありえるか、生まれつきうんが悪いから、、、、

(無題) 削除/引用 No.925-7 - 2009/07/27 (月) 09:37:55 - み >[Re:4] cDNAさんは書きました : > ＞賞味期限の方はECLPLUSと比べてどうでしょうか、、、 > > Femto以外は室温保存なので、長いかと。 > 何より、シグナルがECL/ECLplusより全然強いですよ。お薦め。 > 私はこれで、ECLをやめました。 thermoのフェムト、ピコ、デュラってどれが一番使い勝手良くてシグナルの出し方が汎用的ですか？ 要するにそれら専用のblockingやwashing bufferが必要でなく一般的なprotocolで最後の検出だけ変えれば良いのはどれですか？ バックグラウンドが低く、普通のECLより良いものは？ ECLplusは確かにECLより5-10倍シグナル強いけどバックも高めなので変えたいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.925-6 - 2009/07/27 (月) 09:18:37 - おお >[Re:4] cDNAさんは書きました : > ＞実はむっちゃ新しいんですよ、、、、、 > > きっと水が悪いか、最初のバンドは夢だったかですね、たぶん（笑） は、今目が覚めたような気分。 ついでにうんも悪かったり、、、でもそれはいつものことか、、、 > > そういう時って、しばらく別の実験をして、少したってからやり直すとうまくいきます。（無責任） これなんだか分かるような気がします。 意外とそういう無責任な回答がすきだったりします。 > ＞賞味期限の方はECLPLUSと比べてどうでしょうか、、、 > > Femto以外は室温保存なので、長いかと。 > 何より、シグナルがECL/ECLplusより全然強いですよ。お薦め。 > 私はこれで、ECLをやめました。 ありがとうございます。S/N比がいいというのはうれしいですね。 でもバックが出ないと強くないような感覚がどうしてもあるんですよね。 ちょっと考えてみることにします。サンプルがどっかにころがっている かもしれないなぁ、、、探してみヨット。

(無題) 削除/引用 No.925-5 - 2009/07/27 (月) 08:58:12 - R 現像液がだめになっているときがありましたが、どうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.925-4 - 2009/07/27 (月) 08:46:16 - cDNA ＞実はむっちゃ新しいんですよ、、、、、 きっと水が悪いか、最初のバンドは夢だったかですね、たぶん（笑） そういう時って、しばらく別の実験をして、少したってからやり直すとうまくいきます。（無責任） ＞賞味期限の方はECLPLUSと比べてどうでしょうか、、、 Femto以外は室温保存なので、長いかと。 何より、シグナルがECL/ECLplusより全然強いですよ。お薦め。 私はこれで、ECLをやめました。

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