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(無題) 削除/引用 No.921-4 - 2009/07/27 (月) 06:40:41 - おお >[Re:3] ひつまぶしさんは書きました : > ”カラムを利用したりするエンリッチメント”、というのは具体的には、どんな手法なのでしょうか？ ちょっとてのこんだ方法になると思いますが、 ライセートをイオン交換とか、ゲルろ過に かけて、目的のたんぱく質が得られるフラクション を使うということです。ゲル濾過だと濃度は 上げられませんが、イオン交換だと、濃縮 が可能なので、溶液に存在する目的の タンパク量がおおくなり、抗体との結合に有利です。 核フラクションを取るとの同じように、必要のない タンパクはIPの前にカットしてしまえということです。 うまくやると数カ所フラクションが得られ、どのフラクションが 修飾されているフラクションだとか、違ったタンパクコンプレック の分離もできるので、データーとしてさらなる展開もできると思います。 タンパクの修飾を見るということなので2Dでもある程度 の事がいえるかもしれませんね。 2Dのプレパラティブスケールで、その後IP でもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.921-3 - 2009/07/26 (日) 01:25:17 - ひつまぶし おおさん、大変参考になるご意見ありがとうございます。 抗体自体は、IPで使えることは確認しております。また、WBで用いる方の抗体も、数多くの研究者が使用している抗体なので信頼できると考えております。 今回は、ある内在性蛋白のリン酸化、アセチル化などを見ようと考えております。そして苦戦しております。確かにフラクションをとって評価することも手かと考えております。 ”カラムを利用したりするエンリッチメント”、というのは具体的には、どんな手法なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.921-2 - 2009/07/25 (土) 08:44:57 - おお どのような状態でスタックしているのか分からないので、 一応思いついたことを書きますが、ミスガイドが不安です。 抗体のスケールをかえないで抗原の量を増やすという 観点で確かにサンプルを増やせば多く取れるというのは ちょっと苦しいと思います。 よくサジェスチョンするのはエンリッチメントです。 核に存在するタンパクなら核をとって(サイトゾルの タンパクをのぞいて)、膜に存在するなら膜フラクション をとって、ミトコンドリアに存在するならミトコンドリア をたんりして、という感じです。 たまにそれでウエスタンでノンスペが増えることがありますが 抗体しだいです。 あるいはカラムを利用したりするエンリッチメントというの もてです。 IPなので、イミュノコンプレックスを回収しようということ のように思えますが、そうでないなら1%SDSとかSDSPAGEの サンプルバッファーで変性させて希釈してSDSが抗体に 影響を与えない程度にしてIPというてもあります。 変性でエピトープが露出する分IPがしやすくなるというケース も考えられます。 まあ、あとはバッファーをいじるのはあるかと思いますが、 塩濃度、pH、Ca/Mg、EDTA/EGTA、デタージェントのちょいす とかそういうものでこうを奏する場合がまれにあると思います。 その抗体は過剰発現の系ではワークしているのでしょうか? ワークしているという前提があるかないかで判断が変わってきますので、、 あとはIPウエスタンでインターラクションを見るなら、どうしても ワークしないようであれば、インターラクションしていると思われる 相手のタンパクでIPするても考えられます。

免疫沈降の抗原量 削除/引用 No.921-1 - 2009/07/25 (土) 05:46:09 - ひつまぶし いつもお世話になります。現在、免疫沈降で内在性蛋白と格闘中のものです。 ひとつの手段として、抗原量を増やすというアイデアがあるとは思うのですが、具体的にはどれくらいまで増やすことが可能なのでしょうか？無論、バックグラウンドや用いる抗体の質にもよるとは思うのですが、ご意見を頂ければと思います。

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