全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.918-10 - 2009/07/25 (土) 09:40:14 - なつみかん 通りがかり　さん、 > ルシフェラーゼを組み込んだ permanent cell line を使ってアッセイ？ > その化合物は目的遺伝子のプロモーターに作用でなく、ベクターが組み込まれたゲノム近傍プロモーターに作用？ > ルシフェラーゼベクターを transient に導入した細胞で誘導効果は？ 仰るとおり、permanent cell line です。組み込まれたゲノム近傍のプロモーター活性を見ている可能性（!!）全く考慮していませんでした・・・transientの系での確認実験を組んでみようと思います。 自分で考えすぎて頭が固くなっていたので、皆さんのご指摘大変役立ちます。ありがとうございます。 実は、目的遺伝子はHDAC阻害剤で転写活性が上がる事は分かっているので、HDAC阻害剤もアッセイ系のポジコンとして使っています。 ルシフェラーゼ活性は10倍以上、確率は10割出ます。 RT-PCRは0.05 micro g RNAを用いて、最高50cycleまで回してみる事もあるのですが、今のprimer setではキレイにシングルバンドで増幅されます。が、強制発現系の10割の確率に対し、HDAC阻害剤では5割程度でしか発現が確認できません。取れた化合物では一回も確認できていません。 この辺もルシフェラーゼ細胞とRNA採取細胞の違いに因るのかも知れないですね。

(無題) 削除/引用 No.918-9 - 2009/07/24 (金) 21:16:31 - 通りがかり ルシフェラーゼを組み込んだ permanent cell line を使ってアッセイしたという事でしょうか？ だとしたら、その化合物は目的遺伝子のプロモーターに作用しているのではなくて、たまたまベクターが組み込まれたゲノム近傍にあるプロモーターに作用しているという可能性はないですか？ ルシフェラーゼベクターを transient に導入した細胞でも同じように誘導効果は認められるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.918-8 - 2009/07/24 (金) 20:49:29 - なつみかん あべちゃん　さん、genji　さん、ご指摘ありがとうございます。 ＞ルシフェラーゼアッセイに用いた細胞と、RT-PCR用のRNAを抽出するための細胞は、同じ細胞ですか？ ルシフェラーゼアッセイ細胞はSV40トランスフォーム細胞にレポーター系を導入した細胞です。 RNAを取ったのは元のSV40トランスフォーム細胞、およびさらに元のトランスフォームする前の繊維芽細胞です。 アッセイ細胞はクローニングしてルシフェラーゼ活性の高い物を選んでおり、全く同じ細胞ではありません。 ＞ルシフェラーゼの活性が変化するかは、ルシフェラーゼ反応液とそのケミカルの有る無しでわかるでしょう。 ？これは、化合物とルシフェラーゼ反応液の完全in vitroの系、ということですか？それはやっていません。試してみます。 アッセイ細胞で濃度依存的に活性が上がったので、化合物そのものにルシフェラーゼ活性がある、という可能性も無ではないですね。 プロモーターレスの系も準備したまま使っていないので、試してみようと思います。 う　さん、 ＞ルシフェラーゼアッセイで、化合物を加えていない細胞と加えた細胞との 差がどのくらいあるのか。 500nM添加で基材のDMSO添加に比べて4倍程度のルシフェラーゼ活性です。このとき死細胞が50%くらいです。そのため、RNAを取るときは培養上清も回収しています。

(無題) 削除/引用 No.918-7 - 2009/07/24 (金) 18:49:36 - genji ＞ルシフェラーゼアッセイに用いた細胞と、RT-PCR用のRNAを抽出するための細胞は、同じ細胞ですか？ これは私も一番最初に気になりました。 細胞が違えば化合物に対する応答性も変わる可能性があります。 この手の実験でスクリーニング系をrecomfirmする際に、初めての人は割りとこういったeasyなミスがあります。

(無題) 削除/引用 No.918-6 - 2009/07/24 (金) 18:39:02 - あべちゃん >[Re:5] うさんは書きました : > それに比べてRT-PCRはmRNA１つを検出するのはかなり難しい。 2の30乗は10億ですから。

(無題) 削除/引用 No.918-5 - 2009/07/24 (金) 18:34:06 - う ルシフェラーゼアッセイで、化合物を加えていない細胞と加えた細胞との 差がどのくらいあるのか。 ルシフェラーゼは酵素なので、極端な話、酵素１つだけでも作られたら酵素活性は見られる。 それに比べてRT-PCRはmRNA１つを検出するのはかなり難しい。

(無題) 削除/引用 No.918-4 - 2009/07/24 (金) 18:23:08 - あべちゃん ルシフェラーゼアッセイに用いた細胞と、RT-PCR用のRNAを抽出するための細胞は、同じ細胞ですか？ あと、 RT-PCR、ポジコンでうまくいっているのであれば、感度とかは関係ないと思います。 ルシフェラーゼの活性が変化するかは、ルシフェラーゼ反応液とそのケミカルの有る無しでわかるでしょう。

RT-PCR自体は 削除/引用 No.918-3 - 2009/07/24 (金) 18:05:14 - なつみかん う　さん、ありがとうございます。 RT-PCRでは、目的遺伝子を外来で安定的に強制発現させた細胞系から取ったRNAをポジコンとしており、これの発現は確認できています。 並行して、totalRNAの電気泳動での確認と、GAPDHのRT-PCRを行って、RT-PCRにかかるRNAが取れていることは確認済みです。 RT-PCRのさらなる確認のために、primerをいくつか試してみようかと思っています。 3. 検出感度の問題（ルシフェラーゼ活性が高感度でRT-PCRが低感度、または絶対サンプル量がルシフェラーゼでは10E4細胞、RT-PCRでは 0.05 micro g）で見れていないという可能性？？ などもあるのでしょうか。 化合物からルシフェラーゼ活性に至る経路を、いろいろなノックアウト、ノックダウンでつぶしていく事も考えたのですが、最終的には「遺伝子発現を活性化する化合物」を取りたいので、直接の証拠として遺伝子発現を確認したいのです。

(無題) 削除/引用 No.918-2 - 2009/07/24 (金) 16:42:58 - う RT-PCRがうまくいっているかどうか確認

レポーターアッセイと実際の転写活性 削除/引用 No.918-1 - 2009/07/24 (金) 13:41:29 - なつみかん 安定的なルシフェラーゼレポーターアッセイ細胞系を用いて、恒常的な転写活性・mRNAの発現のない遺伝子の、転写活性を上げると思われる化合物をスクリーニングし、拾って来ました。 実際のmRNAの転写の様子を確認しようと、化合物添加後の細胞からRNAを採取してRT-PCRにかけても、いっこうに発現が確認できません。 1. レポーターアッセイ系のプロモーターとゲノム上のプロモーターの修飾等の違い？ 2. プロモーターに関係なくルシフェラーゼが活性化されていた？？？ 等々、考えているのですが、 手始めに何で確認作業をしたらよいでしょうか？ いいアイデアがあれば是非、お願いいたします。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---