いつも勉強させていただいております。
単純なことなのだと思いますが、行き詰っております
ご相談させてください。
15kbのベクターに2kbのインサートをライゲーションして
DH10B エレクトロコンピテントセルでサブクローニングをし、
Knプレートでセレクションしています。
Knが15 micro g/mLだと30℃で20時間以内に小さなコロニーが100個ほどできたのでこのコロニーをつついてカルチャーし、制限酵素消化でインサートチェックをしてみると、10kb〜20kbのあたりに、スメアがかったバンドが出るばかりでインサートは入っていません。ダイレクトPCRでチェックしても目的のバンドは出ず、インサートは入っていませんでした。なお、シーケンスはインサートの外側のプライマーを使っているにも関わらず読めません。
次に、カナマイシン20 micro g/mL濃度のプレートを試したのですが、コロニーが出ません。（2〜3日待つと出ますが）
15micro g/mLではコロニーが出るのに、20 micro g/mLになると出ない理由は単に、15micro g/mLでKn耐性のコロニーが出ているだけで、インサート入りのコロニーはそこに存在しないということなのでしょうか？
ベクターのコピー数は〜250コピー。
ベクターのみ形質転換をするとカナマイシン20 micro g/mLでもコロニーはできます(それ以上の濃度だとコロニーは出ません）。このベクターで1回だけクローンを取った事がありますが、20 micro g/mLで1個だけ生えていたコロニーがアタリでした。
このクローニングのカナマイシンの最適濃度はやはり20 micro g/mLなのでしょうか？それとも、15 micro g/mLのプレートで出たコロニーをひたすらつついてアタリが出るまで粘るべきなのでしょうか。
ご意見をお聞かせいただければと思います。 |
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