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あのベクターを倒しました 削除/引用 No.912-27 - 2009/08/04 (火) 16:23:32 - クローニングが倒せない 皆様、先日はどうもアドバイス等ありがとうございました。 遂に例のベクターを倒したので、後の方のために条件等を書いておきます。 Vec:Ins＝2:1 Fragmentの大きさ　2kb Vectorの大きさ　15kb TAKARA　Ligation kit LONG　Ligation time 16hrs Kn selection conc.　20micro g/ ml DH10Bpir116　Electrocompetent Transformation後回復時間　2hr 培養温度　37℃ インサート確率　3/15 チェック方法　Colony Direct PCRとSequenceにて 24時間後に生えてきたコロニーに、アタリはひとつもありませんでした。 48時間目のコロニーをつつくと3/15で当たりました。 ご指導くださったみなさま、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.912-26 - 2009/07/28 (火) 09:03:38 - クローニングが倒せない おふたりともありがとうございます。 >拾ったクローンを >線画培養して、あまり長期間培養せず(10時間いないとか)に回収して わかりました、それもやってみようと思います。 >薬剤耐性のユニットのぶぶんが残ってたり、ゲノムに >取り込まれたりしているのかなぁと思ったりします。 グリセロールストックも危ないのですねorz もはや何を疑えばよいのやら・・・ 完全に詰んだので皆さんのアドバイスをもとに次1回やってみて もうあいつがどうしても倒せないなら 今奇跡的に取れてたクローンをもとに、 一度BAC用のGene Targeting Kit Red/ET Recombination kitで改変しようと思っています。 また報告にあがります・・・。

(無題) 削除/引用 No.912-25 - 2009/07/28 (火) 05:46:05 - おお >[Re:18] クローニングが倒せないさんは書きました : > > これまで不安定なベクターを使ったことがなかったのですが、 > ゲノムに組み込まれたり、すぐに大腸菌が増えなくなったり、 > こういうことはよく起こることなのでしょうか・・・。 ここまで極端なものは扱ったことはないですが、 大きいプラスミドは不安定で若干取り扱いが 難しい場合がまあまああります。それとか 大腸菌ないで発現するようなコンストラクトで 大腸菌に悪さするようなものが組み込まれている場合とか。 まずグリセロールストックが信用できませんね。 通常のでも私は信用していませんが、大きいやつはもっと 信用してません。 大量培養で変なプラスミドが取れたり(短くなっているとか どんな制限酵素で切っても期待していないところにバンドがでるとか)、 ほとんど取れなかったり。 そういうものを詳しく解析することはないので実際に 何が起こっているかは分からないことがおおいのですが、 薬剤耐性のユニットのぶぶんが残ってたり、ゲノムに 取り込まれたりしているのかなぁと思ったりします。

(無題) 削除/引用 No.912-24 - 2009/07/27 (月) 10:08:05 - AP 立ち入った詳細は結構として、おそらくGateway systemの前身のエントリーベクターのようなもので、今は後続のベクターに取って代わられたpUni/V5-Hisかそれの派生ベクターということのようですね。

(無題) 削除/引用 No.912-23 - 2009/07/27 (月) 07:21:02 - おお やはりORIがクラッシックなベクターと違いましたか、、、、 そこを抑えておかなければと思っていましたが、、、 あまり経験のないところなのでなんともいえませんが、 高分子のゲノムがでてくる絵はあまり見ないので菌が 弱っているようなきもしてきています。 DNaseとか組み込んでいる見たいなことはないでしょうか、、、、 それとどこかから譲ってもらったものであれば、一度状況 を報告して見た方がいいかもしれません。不安定なプラスミド であれば、送ってもらったクローンがすでにおかしいという 場合もありますので、相手がそれはおかしいと思えば再送という こともあるでしょう。 サイズにもよるかもしれませんがBAC用のミニプレップキットとか もいいかもしれません。 それと、特に弱りがちな場合だと温度やこうせいぶっしつの 濃度をいじるのは確かですが、培養方法もいじれます。 あまりちゃんとした方法は知らないのですが、プレート で大腸菌を飼う方が安定です。拾ったクローンを 線画培養して、あまり長期間培養せず(10時間いないとか)に回収して プラスミドをとるとか、、、、 ライブラリーを作る時にドロドロのゲル中で増やすプロトコール もあったと思います。

(無題) 削除/引用 No.912-20 - 2009/07/25 (土) 21:45:43 - AP 後学のために、どんな骨格のベクターを使っているのか教えてください。 ちょっと調べてみたんですが、pir/pir116のホストでなければ増えないということはR6K gamma oriのベクターのようですね。同時にcolE系の oriを持っているベクターもあるようですが、そういうのではないわけですね。 R6K gamma oriのレプリコンは複製にpir遺伝子産物のPi タンパク質が必要で、本来のコピー数は15程度、しかしpir116 mutantではそのコピー数が250くらいに上がるということのようですね。不安定なプラスミドはコピー数が高いと崩れやすいので、ただのpir（野生型pir）の系統にスイッチしたらいいかもしれません（そういう目的で野生型pirの宿主もavailableになっているようです）。 カナマイシンのworking conc.は、stringent plasmid（数コピー程度）で20 ug/mL、relax plasmid(数十から数百コピー）で50 ug/mLです。本当に、250コピーあるなら、20 ug/mLで増えないということは考えにくいのですが。コピー数がせいぜい2、3個のBAC クローンを生やすときでも20 ug/mLでやりますけれど。

あのベクターが倒せない 削除/引用 No.912-18 - 2009/07/25 (土) 17:14:29 - クローニングが倒せない 皆様、ご指導ありがとうございます。 使える菌体はDH10Bpir116か、pirの入っている大腸菌のみです。 それ以外の菌体だと増えないのだそうです。 今日、15micro g/mLのプレートで生えていたコロニーで 30micro g/mLの液体培地で耐性を示したものが10検体ほど取れたので 取れたコロニーから抽出したDNAをnocutで泳動すると、35kb〜50kbに少しスメアバンドらしきものが出ます。制限酵素でチェックしてみたところ、ベクターサイズは合っているのですが、やはり少しスメアがかった薄いバンドになっており、インサートも入っていません。 しかも普段のミニプレップと比べてやたらゲノムの混入があり、ゲノム：フラグメントが3：1ほどの割合で出ます。（もちろん、ミニプレップのときにボルテックスなどの妙な操作はしておりませんし、普段は殆どゲノムは出ません）そして、こういう現象は単純に空のベクターをトランスフェクションして得たコロニーから抽出したDNAでは起こりません。 問題のベクターの2箇所切断の電気泳動図（KpnI/HindIII) http://imepita.jp/20090725/618830 見やすいようコントラストを上げていますが、 泳動図としてはもっとバンドが薄い感じです。 一体何が起こっているのでしょか。 ちなみに、空のベクターのMCSに予め500bpほどのフラグメントを仕込んでいて、ベクターが完全消化できていなかったクローンを拾った場合にはフラグメントが出るのですぐ分かるようにしておいたのですが、仕込んでおいたフラグメントも出ませんので、ベクターは制限酵素消化で完全消化されたうえ、ライゲーションを経て形質転換できていたのだろうと思います。 また、制限酵素はきちんと切れることを確認しています。 とすると、これは大腸菌ゲノムの中にベクターが組み込まれてしまったのでしょうか？何が起こっているのかさっぱりわかりません。 これまで不安定なベクターを使ったことがなかったのですが、 ゲノムに組み込まれたり、すぐに大腸菌が増えなくなったり、 こういうことはよく起こることなのでしょうか・・・。 回復培養ののち高めの濃度のKnでセレクションしてからプレートにまくという方法も試しましたが、全てインサートなしのクローンばかり（30個ほど）出ました。もしかすると同一クローンなのかもしれません。 フラグメントを別々にクローニングすることも試しました。 ベクターを分割して小さくし、別のオリジンを使うと嘘のように増えるようになりましたが、結局、完全な元のプラスミドにするときにやはり同じように奇妙なことになります。 色々試してみたのですが、挫折しかけております。

(無題) 削除/引用 No.912-17 - 2009/07/25 (土) 12:22:49 - 通りがかり SURE とか Stbl のような菌株は試されましたか？

サブクローニングの戦略 削除/引用 No.912-16 - 2009/07/25 (土) 12:14:06 - ats サブクローニングの戦略を変えるのは、どうでしょうか。 15+2=17ではなく、10+(5+2)みたいに、ベクター由来の断片＋目的断片を別のベクターにサブクローニングしてから、目的プラスミドへのライゲーションを行う方法です。 適切な制限酵素部位が見つからないと困難ですが。 可能なら、薬剤耐性遺伝子部分とプラスミドoriを分けて最終ライゲーションに持ち込めると、効率がよいです。

(無題) 削除/引用 No.912-15 - 2009/07/24 (金) 21:05:23 - zuum 問題のベクター部分を 1cut するような制限酵素でライゲーション産物を切断し、電気泳動でチェックしてみてはどうでしょうか？ 15 + 2 = 17 kb のバンドがあればライゲーション自体は問題ないと思われますが、それでもコロニーがでないなら、In-Fusion でも無理なような気がします。 回復培養した後にプレートにまくのではなく、回復培養したものをカナマイシン含有液体培地 (30-40 ug/mL)で一晩培養してからプレートにまいてみてはどうでしょうか？この方法がいいかどうかわかりませんが、だめもとで。

(無題) 削除/引用 No.912-14 - 2009/07/24 (金) 15:56:20 - クローニングが倒せない おおさま、どうもありがとうございます。 そうだったのですか、どうりで取れないと思いました。 ＞例えばベクターを大腸菌から増やしなおしたり しても一緒ですか? やりました、オリジナルストックを起こしても同じ結果になりました。 菌株を変えてみたり抗生物質をAmpなどに変えてみようともしましたが、 結局何か配列をいじろうとするとこのベクターだけが おかしなことになりました。 ・抗生物質の濃度を上げてセレクションするとベクターサイズが小さくなる ・クローンはなかなか増えないが、長く培養しているといつの間にかプラスミドが抜ける このベクターを経由しなければどうしても 次のステップに進めないのですが、 普通に制限酵素消化からLigationのクローニングができないとなると Infusionなどの方法を使ってみるべきでしょうか。 要するに目的のフラグメントを問題のベクターに入れられれば どんな方法でもいいんですが・・・。 何かよい方法がありましたらお教えいただければと思います。 また、私の手技なども見直してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.912-13 - 2009/07/24 (金) 14:41:18 - おお >[Re:11] クローニングが倒せないさんは書きました : > 大事な事を書くのを忘れていました > 問題のベクターの形質転換効率はは20ug/mgのとき、 > 空の状態で10^3 cfu/ug未満（600〜800ぐらい）です。 > これでは効率が低すぎてクローニングができないのですね。 そんな効率ではやらない方がましです。 例えばベクターを大腸菌から増やしなおしたり しても一緒ですか? 非常に不安定なベクターなようなので精製した時に おかしくなっているとか、、、、、 少なくともたのベクターではワークしていますので、 プラスミドに問題がありとみた方が良さそうです。

(無題) 削除/引用 No.912-12 - 2009/07/24 (金) 14:26:56 - クローニングが倒せない 回復培養のときはSOC培地を使っています。 大事な事を書くのを忘れていました 問題のベクターの形質転換効率はは20ug/mLのとき、 空の状態で10^3 cfu/ug未満（600〜800ぐらい）です。 これでは効率が低すぎてクローニングができないのですね。 大量にDNAをぶち込むしかないのでしょうか。 >Knが20以上の濃度だと、空のベクターでもプレート上では増殖しません。 申し訳ありません、記載ミスです。 20はまだコロニーが出来ます。20より濃度が濃いとプレート上ではコロニーができません（が、液体培地では30か、ギリギリ40までは増えます）。 ここはあえてケミカルコンピにした方がよいのでしょうか。 確かに、市販のものはケミカルしか売っていませんでした。 エレクトロの方が効率がよさそうなものなのに何。故だろうと思ったのですが、何か理由があるのかもしれません。 InFusionも試してみようと思ったのですが、メーカーにベクターが10kb以上のものはちょっと・・・と言われクローニングに戻ってきました

(無題) 削除/引用 No.912-10 - 2009/07/24 (金) 12:21:22 - おお >[Re:7] クローニングが倒せないさんは書きました : > > 回復培養の時間は2時間と、長めにとっています。 > これはちょっと長いなあ、、、カナマイシンはこの時は入っていませんよね、、、、 結構やっかいなプラスミドを使っているようですね。 それで30度にしたりKMの濃度を微妙に調整しているのですね。 確かにそういうやっかいなやつは30度で培養というてを とるとベターな場合があるようです。 さほど系に問題がなくて、それでもかんばしくない場合は、 コンピのきん株を変えるというのもあります。 ポレーションの方がベクターサイズからして良いとは 思いますが、あえてケミカルにしてみても良いかもしれません。 すべての系が確実でしかもうまく行かない時は、そういった 理屈では無いところをいじったりたまにします。

え、何でその結論？ 削除/引用 No.912-9 - 2009/07/24 (金) 11:48:04 - ~ >Knが20以上の濃度だと、ベクターのみでもプレート上では増殖しません。 ということは、そのベクターでのタイターは0ですよね。 このデータを持っているのに、 >次からは20micro g/mLで行おうと思います。 という結論に達した理由は何ですか？ 空ベクターが生えないのに、インサート入りのベクターが生えるのを期待するのは無理があるでしょう。 >市販コンピも試してみたけどいずれはKnに飛ばされる 飛ばされるの意味が分かりませんが、自作コンピをメインに使っているのですよね。 1本コントロールを増やしてもたいしたコスト増にはならないでしょうから、 空ベクターを同時に入れて、そのベクターのサイズでのタイターを測定してみてはいかがでしょうか。 空ベクターで10^3 cfu/ug DNA未満であれば、1ngのライゲーション産物をライゲーションしても、1個未満のコロニーしか得られることは期待できないでしょう。

市販コンピも試してみたけどいずれはKnに飛ばされる 削除/引用 No.912-7 - 2009/07/24 (金) 10:08:12 - クローニングが倒せない 皆様、ご指導ありがとうございました。 なるほど、やはりベクターが入っていない可能性が高いのですね。 すっきりしました。深追いしなくてよかったです。 15micro g/mlで生えてきた今までのコロニーはもうつつかず、 次からは20micro g/mLで行おうと思います。 エレクトロコンピの形質転換効率は2kbのベクターで1x10^8 pfuほどあり、 ポジコンもその他のクローニングも問題なくワークします。 コンピのコンタミにつきましてはベクターなしでコンピをプレートに まいてチェックしてみようと思います。 回復培養の時間は2時間と、長めにとっています。 予備実験として、ベクターが入っていると分かっているクローンをKn濃度を振ってプレートにまきました。 Knが20以上の濃度だと、ベクターのみでもプレート上では増殖しません。コロニーを取って、液体培地でKn 30 micro g/mLで培養すると増殖しはじめます。50 micro g/mLで培養すると増殖せず、たまに増殖したかと思えばベクターが大腸菌の中でちぎれてベクターサイズが小さくなっていましたので気持ち悪くてそれ以来やっていません。 30度で培養するのは、37度で培養したときより増殖がよくプラスミドがたくさん取れたことと、ベクターをいただいた方に30度を推奨されたからです。 37度でも検討してみようと思います。 ライゲーション効率も自信がないので、TAKARAの長鎖用ライゲーションキットでも試してみようとおもいます。 私自身の操作もよくないのでしょうが、同じサイズのほかのベクターを同じコンピで行ったときには60〜80％の確率でベクターにインサートが入っているので、今回のベクターの性質もあるのかなと考えています。 ありがとうございました、またご報告に参ります。

だからポジコンだけは最後にとっておく 削除/引用 No.912-5 - 2009/07/24 (金) 06:17:04 - おお ベクターにしろ、大腸菌に導入されれば、効率に影響はあれど、50ug/mlでも 生えてくるのではと思えます。 まず15ug/mgではえて20とか25ugではえないのであれば、プラスミドは 菌の中に入ってないと思ってもいいのではとおもえます。 そんな状態で15ug/mlでクローンができるなら、コンピテントにコンタミがあるかそのほかからコンタミを持ち込んでいる可能性が高いのではないでしょうか。 コンピテント自体やトランスフォーメーションの系自身がワークしていない可能せいも考慮に入れた方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.912-4 - 2009/07/24 (金) 04:28:02 - Kn濃度 >[Re:1] クローニングが倒せないさんは書きました : > 15micro g/mLではコロニーが出るのに、20 micro g/mLになると出ない理由は単に、15micro g/mLでKn耐性のコロニーが出ているだけで、インサート入りのコロニーはそこに存在しないということなのでしょうか？ ベクターなしのコントロールでは生えてこないのでしょうか？インサートの以前の問題で、プラスミドベクター自体が入ってない感じですが。 > このクローニングのカナマイシンの最適濃度はやはり20 micro g/mLなのでしょうか？それとも、15 micro g/mLのプレートで出たコロニーをひたすらつついてアタリが出るまで粘るべきなのでしょうか。 > > ご意見をお聞かせいただければと思います。 まずクローニングはじめる前に、ベクターのあるなしでKn濃度検討をしましたか？ご質問から推察すると最適濃度を検討せず実験していらしゃるようにお見受けしました。既知であってもうまく行かないならご自身の条件で確認したほうがよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.912-3 - 2009/07/24 (金) 01:22:47 - AP 回復培養のプロトコールはどうなんでしょうか？ 30℃で培養しているのはどういう理屈からでしょうか（oriによっては低温培養でコピー数が減るわけですが）。

(無題) 削除/引用 No.912-2 - 2009/07/24 (金) 01:03:16 - ~ >ベクターのみ形質転換をするとカナマイシン20 micro g/mLでもコロニーはできます これが今でも再現性があるのでしたら、20ug/mLでセレクションした方がいいと思います。 また、ベクター無しで15ug/mLで生えるかどうかは見たことがありますか？ その確認無しに15ug/mLのプレートに撒くのはどうかと思います。 今扱っているエレクトロコンピのタイターは測定していますか？ ライゲーション効率か、タイターの少なくとも片方が悪いのだと思います。 ライゲーション効率を確認するのは難しいでしょう。 まずはタイターをチェックされてはいかがでしょうか。 >このベクターで1回だけクローンを取った事がありますが、20 micro g/mLで1個だけ生えていたコロニーがアタリでした。 その時の条件が分かりませんが、ベクターが大きいとはいえ、あまりいい条件で操作が出来ていないのだと思います。 ベクター、インサートの精製や比率、ライゲーション条件などについても、一度見直してみてはいかがでしょうか？

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