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(無題) 削除/引用 No.907-5 - 2009/07/23 (木) 04:37:34 - おお モノクロがIgMだったりと言うことはないですよね。 IgGもサブタイプで若干しんわ性が変わってきますが IgGであればまあ大丈夫とは思いますけど。 http://www.piercenet.com/files/TR0034-Ab-binding-proteins.pdf

(無題) 削除/引用 No.907-4 - 2009/07/22 (水) 23:14:28 - おお >[Re:3] 懲りん星人さんは書きました : > おお様 > 早速の御返信ありがとうございます。 > このモノクロはウエスタンブロットでも使用可能です。 > 強制発現用のベクターにはタグが入っておりません。 > 権利等の関係で、ベクターをいじることが出来ない状況 > にあります。 お気付きかと思われますが、または確認済みかもしれませんが、 モノクロIP後、同じ抗体でいいからウエスタンしてみれば、 IPに問題があるか分かるのではないでしょうか。 もちろん抗体とサイズがかぶるとひと工夫ひつようですが。 そこでIPに問題がないならビオチンのラベルの問題を考え ないといけないですよね。 アビジンでプルダウンというのも少なくとも条件を決めるのなら 有効だと思いますがどうでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.907-3 - 2009/07/22 (水) 23:01:44 - 懲りん星人 おお様 早速の御返信ありがとうございます。 ＞そのモノクロはウエスタンできますか? ＞ウエスタンがダメならELISAは? ＞できないなら、標的分子にタグを入れることができますか? このモノクロはウエスタンブロットでも使用可能です。 強制発現用のベクターにはタグが入っておりません。 権利等の関係で、ベクターをいじることが出来ない状況 にあります。

(無題) 削除/引用 No.907-2 - 2009/07/22 (水) 22:26:14 - おお >[Re:1] 懲りん星人さんは書きました : > > という流れです。問題は分子Aも検出されないことでなのです。 > ビオチン化がうまくいっていないのか、lysis buffer中で > 分子AとモノクロBが結合していないのか位しか原因が思いつき > ません。 > 大きな枠での問題提示ができていますので、 これを元にどのように各ステップが確認できるか、 確認できるシステムを構築できるか考えてみればいいのでは? ヒントになりそうなものは、、、、、 そのモノクロはウエスタンできますか? ウエスタンがダメならELISAは? できないなら、標的分子にタグを入れることができますか?

免疫沈降がうまくいかない 削除/引用 No.907-1 - 2009/07/22 (水) 22:19:01 - 懲りん星人 お世話になっております。 研究を始めて３年程になります。 行き詰まってしまったため、こちらで質問させていただきます。 ある細胞表面分子Aに会合する分子がないか検討しており、 分子Aを強発現する安定クローン株を取得しました。その細胞株と 分子Aに対するモノクロBを用いて、免疫沈降を行いました。 １００％の安定クローン株に分子Aが発現していることをモノクロB で確認しました（FACSによる）。 免疫沈降の手順としては、 （１）安定クローン株をビオチン化 （２）lysis buffer(１％ triton又は1% NP40)に溶解 （３）プロテインGセファロースを添加、遠心 （４）上清にモノクロBを添加、プロテインGセファロース添加 （５）プロテインGセファロースを回収、SDS-PAGE bufferへ （６）SDS-PAGE、トランスファー後、ストレプトアビジンでブロット （７）X線フィルムで検出 という流れです。問題は分子Aも検出されないことでなのです。 ビオチン化がうまくいっていないのか、lysis buffer中で 分子AとモノクロBが結合していないのか位しか原因が思いつき ません。 また、ナチュラルに分子Aを発現している細胞を用いても結果は 一緒で、FACSでは検出可能でしたが、免疫沈降後に分子Aは 検出できませんでした。 宜しくお願い致します。

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