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(無題) 削除/引用 No.907-25 - 2009/08/02 (日) 22:25:52 - httt こちらのスレを興味深く拝見しておりました。 私も殆ど同じような検討をしている者です。 こちらのスレでスレ主以外が質問するのは、非常に 恐縮なのですが、X線フィルムで出てきたバンドの 解析はどのようにするのでしょうか。 例えば銀染色でも検出されないような量ですと、 ペプチドシークエンスも出来ないと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.907-24 - 2009/08/01 (土) 19:06:44 - 懲りん星人 あれからバッファをすべてTBS-Tにし、ストレプトアビジンの濃度を 薄目にし洗浄をしつこく行いました。すると、バックグラウンドが 抑えられ、目的のバンド以外にコントロールサンプルにはないバンドを 検出することができました！ アドバイス、コメントを下さった方々に感謝致します。

(無題) 削除/引用 No.907-23 - 2009/07/30 (木) 02:24:57 - Tb > 結合したとしても立体構造上かなり結合力が弱くなっているのではないかと思うのですが・・・ 付け足しですが、普通タンパクラベルに使うビオチン化試薬はいわゆるlong arm biotinというもので、ペプチド鎖から少し離れたところにビオチン構造部がでているようなものを使い立体障害を置きにくくしています。トピ主さんのもそういうのですね。

(無題) 削除/引用 No.907-22 - 2009/07/30 (木) 01:33:53 - おお >[Re:21] Tbさんは書きました : > DCさん、 > > そもそも、ビオチン標識タンパクをSDS-PAGEしてアビジンがWBで結合するんですか？ > > これは問題ないです。細胞表面ビオチン化、WB検出は広く使われてます。ビオチンは低分子化合物なのでいわゆる変性という概念はないですし。。。 > 余談ながら、ストレプトアビジンの結合力は強く、かなり過酷な条件、例えばSDS存在下でも結合します。 賛成です。

(無題) 削除/引用 No.907-21 - 2009/07/30 (木) 01:05:36 - Tb DCさん、 > そもそも、ビオチン標識タンパクをSDS-PAGEしてアビジンがWBで結合するんですか？ これは問題ないです。細胞表面ビオチン化、WB検出は広く使われてます。ビオチンは低分子化合物なのでいわゆる変性という概念はないですし。。。 余談ながら、ストレプトアビジンの結合力は強く、かなり過酷な条件、例えばSDS存在下でも結合します。 ただ細胞表面のビオチン化は均等に起こるわけではない、というのは別問題ですが。。。

(無題) 削除/引用 No.907-20 - 2009/07/29 (水) 20:24:07 - 懲りん星人 DC様 コメントありがとうございます。 細胞表面をビオチン化後にSDS-PAGEを行い、ストレプトアビジンで 検出している論文があったため、行っている状況です。 これまでに経験がないため、少々不安ではありますが。

(無題) 削除/引用 No.907-19 - 2009/07/29 (水) 17:48:41 - DC トピックとは直接関係ないかもしれませんが・・・ そもそも、ビオチン標識タンパクをSDS-PAGEしてアビジンがWBで結合するんですか？ イメージ的には結合しないか、結合したとしても立体構造上かなり結合力が弱くなっているのではないかと思うのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.907-18 - 2009/07/28 (火) 09:33:27 - 懲りん星人 C様 コメント、アドバイス有難うございます。 臨床系の部屋にいるため、基礎研究に詳しい人がおらず 困っておりました。 アドバイスを元に検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.907-17 - 2009/07/28 (火) 01:11:22 - C westwesternとかいうやつはいいかもしれないです。細胞の全ラーゼートあるいは膜画分を電気泳動してそれを膜にブロットします。膜をよく洗ってからブロッキングして（ブロッキング剤は分子Aが含まれていないこと。）つぎにそのブロットを分子Aを含む溶液でインキュベートします。コントロールはAを含まない溶液で同じようにインキュベートします。次いでよく洗ってから、抗分子A抗体でインキュベートします。ここからは普通のwesternと一緒のやり方です。何かコントロールにはないシグナルが出れば、それが分子Aと直接相互作用する蛋白質と考えられます。欠点は一度変性しているので高次構造が重要な相互作用には向かないです。洗ってるうちにSDSがある程度除去されて膜上でそれなりに再生はするかもしれませんし、蛋白質によっては再生させる方法もあるようなので、可能性はありますが。 免疫沈降で共沈してくる蛋白質として捕まえる事も悪くないのですが、欠点は直接相互作用しているのかどうか分からないことです。とくにいろんな蛋白質とインターラクションしていたり、複合体を形成して、さらにそれが別の複合体と相互作用してたりすると芋ずる式にいろんな蛋白質を連れてきてしまうため、直接にはあまり縁のない蛋白質をパートナー（すごく広い意味で解釈すればパートナーとも言えるのですが）と誤認して追いかけてしまう可能性もあるので。 あと免疫沈降は原理的に考えてポリクロの方が成功率は高いです。モノクロだとパートナー蛋白質などで唯一のエピトープが隠されてしまうともうつかえないですが、ポリクロならまだ別のエピトープでいけるチャンスがあるので。もし免疫したマウスからの抗血清がまだあれば、それ使ってみる手はあります。

(無題) 削除/引用 No.907-16 - 2009/07/28 (火) 00:09:33 - 懲りん星人 ばいやさま、おおさま これまで、PBS-TとTBS-Tの使い分けがあやふやだったのですが、 こういったときに使いわけるのですね。TBS-T中にALPストレプト アビジンでブロットしてみます。 でも、前回モノがIPされているかを検出したときも、 ALPのanti-mouse IgGだったのですが、検出できました。 抗体の性質によるのでしょうか。 C様 今扱っている分子Aは正体が全くわかっておらず、モノクロも 販売されていません。モノクロ取得による論文がひと段落ついて 、ラボ全体が「未知の会合分子やリガンドが存在するはずだ！」 と、根拠のない雰囲気になりました。私がモノクロを取得したこと もあり、上司の過度の期待に少々参っています。何か取れれば 良いのですが。

(無題) 削除/引用 No.907-15 - 2009/07/27 (月) 10:23:06 - おお >[Re:14] ばいやさんは書きました : > > ストレプトアビジン（ALP)をブロットする際のバッファは1%BSA/0.1%tween/PBSで行いました。 > > > ALPを使うのにPBSを用いたのですか？リン酸が阻害しているのでは？ > あ、これだ! みすごしてた。

(無題) 削除/引用 No.907-14 - 2009/07/27 (月) 10:02:17 - ばいや > ストレプトアビジン（ALP)をブロットする際のバッファは1%BSA/0.1%tween/PBSで行いました。 ALPを使うのにPBSを用いたのですか？リン酸が阻害しているのでは？

(無題) 削除/引用 No.907-13 - 2009/07/25 (土) 03:05:29 - C 実験の順番として、この実験の前提として、細胞表面分子Aと安定に会合するような膜蛋白質があるかもしれないというそういう仮説に至るデータがあったのだと思うのですがそれはどのようなものでしょうか。もしそういった分子が存在しなければ、免疫沈降やビオチンラベルは問題なくても、期待するデータは得られないとおもうし、またそれが正しい結果という事になると思います。書かれている内容だけからは、そういう分子があるはずなのにどうしても捕まえられず困っているというようにうけとれたので、ちょっと心配な気がしました。 ストレプトアビジンのブロッティングのコントロールの方でシグナルが出ても、生理的な翻訳後修飾でもともとビオチン化を受けている細胞内蛋白質もけっこうあるとおもうので、かならずしも非特異的な反応とは限らないようにもおもいます。

(無題) 削除/引用 No.907-12 - 2009/07/24 (金) 23:54:30 - Tb > ストレプトアビジン（ALP)をブロットする際のバッファは1%BSA/0.1%tween/PBSで行いました。 本当に問題になるのかどうかわかりませんが、教科書的にはBSA画分にもビオチンが含まれている可能性があるということで、BSAの使用も推奨されていません。ブロッキングタンパクなしのTweenバッファーで希釈するか、biotin-freeをうたっているブロッキング材を使うか、です。私はPierceのSuperBlockを10倍薄くしたもので希釈し、SA-HRPは5または10 ng/mlくらいで使ってます。 抗体で落としたあと、Sreptavidin-beadsで濃縮するという手もありますが、未知のほしい分子がビオチン化がうまくいっていることが前提になりますし、またそうしないと見えないという条件ではそれが本物か自信が持てないでしょうから、あまり意味ないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.907-11 - 2009/07/24 (金) 23:49:53 - East 使われている抗体がモノクロ抗体との事なので、細胞上の分子Aがビオチン標識されたために抗原性が失われているのではないですか。免沈した後にウェスタンで検出されたのは、この抗原部位がビオチン化によっても失われなかったものが、もしくはビオチン化されなかった残りのものが検出されただけではありませんか。だから、Strepoavidin-HRPでは検出できなかったのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.907-10 - 2009/07/24 (金) 20:38:44 - 懲りん星人 Tb様、コメントありがとうございます。 ビオチン化というのは思ったより効率が悪いのですね。 初めて知りました。 ＞＞でも気になるのは、streptavidin-HRPでなにもバンドが出なかったので＞＞すか？私の時はisotype controlでもノンスペバンドが複数でましたけ＞＞ど。 ＞＞念のために確認ですが、streptavidinを使うときはnon-fat milkは使え＞＞ませんが、違うのでブロッキング溶液で希釈してますか？ ストレプトアビジンで検出したとき、スメアなバンドのようなものは ありましたが、果たしてそれがバンドなのか不明でした（私の隣の 人は、それはバックグラウンドだろうと言いました）。洗いが足りない のかと思い、念入りに洗いを行い再びやりましたが、結果は一緒でした。 ストレプトアビジン（ALP)をブロットする際のバッファは1%BSA/0.1%tween/PBSで行いました。

(無題) 削除/引用 No.907-9 - 2009/07/24 (金) 09:02:27 - Tb 私もつい最近までほとんど同じことをやってました。私の場合も、私の分子Ａはラベルされているのが検出されませんでしたが、Westernで落ちていることは確認できたこと、SA-HRPで複数のバンドがみられたことから、そのなかに本物があるのかという次のステップにいきました。 細胞表面のビオチン化はかなり効率が悪いと読んだことがあります。全分子の1%くらいしかラベルできず、またされやすいもの、まったくされないものとタンパクによって異なるそうです。私の場合は分子Ａはビオチン化されないものだったけど、Ｂは幸運にもされるものだった、ということになります。もし、トピ主さんのＢがされないものだったら、この手法は使えないことになります。条件といってもそんなに変えるところはないのではと思いますし・・・ また、可溶化したときに会合状態がどれくらい保たれているのかというのもありますね・・・ でも気になるのは、streptavidin-HRPでなにもバンドが出なかったのですか？私の時はisotype controlでもノンスペバンドが複数でましたけど。 念のために確認ですが、streptavidinを使うときはnon-fat milkは使えませんが、違うのでブロッキング溶液で希釈してますか？

(無題) 削除/引用 No.907-8 - 2009/07/24 (金) 07:40:30 - おお >[Re:7] 懲りん星人さんは書きました : > そうなると、細胞のビオチン化がうまくいってないので > はないかと思っています。私が使用している試薬は > ピアスのEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin を使用しています。 > また、アミノ基の介してビオチン化されるみたいなのですが、 タンパクがそれぞれの性質をもっていてそれぞれ扱いが 異なるように、クロスリンカーに対しての反応性も やはりタンパクによって違ってきてあるタンパクで うまくいってもほかのタンパクでうまく行かなかったり というのは有りがちなことだと思います。 もし、クロスリンカーの反応じたいが問題と思われるなら、 文献など探して、ワークしているタンパクをプルダウン して、みるのは手だと思います。 多分確認されていると思いますが そのターゲットのタンパクのアミンが細胞表面に出ているかどうか も考慮に入れるべきですね。 濃度に関しては標準的な物があるとは思いますが、 前後いくらか振って最適濃度を確認する方が無難だと思います。 バッファーも幾らか選択肢はありますし、、、 結局系が動かなければいそがばまわれで外濠を埋めていきながら 判断していくのが確実と言えるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.907-7 - 2009/07/23 (木) 19:41:43 - 懲りん星人 おおさまにアドバイスを頂き、 免疫沈降した抗体で、ウエスタンブロットを行いました。 結果、目的の位置にバンドが見えました（コントロール 抗体で免疫沈降したサンプルでは見えませんでした）。 よって、免疫沈降は動いていることが判りました。 そうなると、細胞のビオチン化がうまくいってないので はないかと思っています。私が使用している試薬は ピアスのEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin を使用しています。 こちらの過去ログを少し調べたのですが、ビオチン濃度が 濃いと良くないとありました。付属のデータシート通りの 濃度で反応を行っているのですが、何かアドバイスありましたら お願い致します。 また、アミノ基の介してビオチン化されるみたいなのですが、 分子Aの細胞外ドメイン約100アミノ酸の内、塩基性アミノ酸は ３つしかないのですが、これですとビオチン化は殆どされて いないということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.907-6 - 2009/07/23 (木) 07:12:04 - 懲りん星人 おおさま 使用しているモノクロはIgGです。 ビオチン化も気になるのですが、 まずはモノクロIP後、同じ抗体でウエスタンして みます。ご指摘ありがとうございます。

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