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(無題) 削除/引用 No.906-6 - 2009/09/28 (月) 17:47:45 - run BL21 codon (+)株はIPTGで発現誘導できないのではないですか？ IPTGによる発現誘導にはλDE3遺伝子が必要ですから。

(無題) 削除/引用 No.906-5 - 2009/07/22 (水) 22:10:46 - AP >可溶画分と不溶画分とに分けてCBBでバンドを見てみるとどちらにもはっきりとしたバンドがあるのかよくわからない。 ような程度では、まともに発現していないです。典型的には、CBBですら明確に判別できるバンドがでます。そうでないものは、タンパク質の性質やmethodologyになんらかの問題がある考えます。 >私はまったく発現されないわけではないけど、何らかの理由があって精製ができないのかなと解釈しているところです。 >目的のバンドがまったくないわけではないのですがほとんど溶出できていませんでした。 たしかに全く発現されていないわけではないでしょうが、発現量がわずかなのがわかっているのに、なんで、精製段階、それも溶出できていないところに問題があると判断したのか理解に苦しみます。最初からたいして存在していなかったんだから、それ以前の問題と考えるのがまっとうなところですが。 この商売、データーから虚心に見て考えるよりも、先入観や我田引水的な考え方が勝ってしまうようでは、命取りですよ。

(無題) 削除/引用 No.906-4 - 2009/07/22 (水) 22:00:42 - おお 細かいところはかなり丁寧な解説がついていますので、 ウエスタンなどで発現や溶出など追ってみてくださいとだけ 書いておきます。 やはり、無理やり関係ないたんぱく質を発現されたり するので、発現量は非常に低いタンパクもしばし見られます。 1Lから精製して5%ぐらいながして辛うじてCBBで染まるくらいだったという たんぱく質も知り合いが経験しています。 あとは不溶画分にどのくらいあるかでストラテジーも変わってくるかもしれません。

訂正 削除/引用 No.906-3 - 2009/07/22 (水) 21:38:56 - 笑い男 >[Re:2] 笑い男さんは書きました : > > 菌体にとって毒性である、タンパクが急速に分解されてしまうなどの理由が考えられるのでしょうか？ > > 　考えられます。　ただ私なら一番に、発現条件が悪いとか、ソニケーションで変性したとかを疑いますが・・・。 > 　考えにくいと思います（こっちに訂正します） 毒性とか分解などは、発現量が低いときの可能性として考慮するものですよね。 　精製できるかor notという問題は、発現量とは関係ないですよね。活性を維持したＧＳＴがグルタチオンと相互作用をしめしているのかどうか？という事が本質ですよね。だから毒性とか分解は考えられないと思います。 　結合しているけど溶出していないという可能性として、ゲルの中でタンパク質が凝集しているという事も可能性として考えられます。

(無題) 削除/引用 No.906-2 - 2009/07/22 (水) 21:03:53 - 笑い男 > 菌体にとって毒性である、タンパクが急速に分解されてしまうなどの理由が考えられるのでしょうか？ 　考えられます。　ただ私なら一番に、発現条件が悪いとか、ソニケーションで変性したとかを疑いますが・・・。 > 可溶画分と不溶画分とに分けてCBBでバンドを見てみるとどちらにもはっきりとしたバンドがあるのかよくわからない。そこで可溶画分から 　どっちにあるのか解らない。発現しているかどうかすらわからない。 それなのに、なぜ精製ステップに進んだのかが伝わってきませんでした。 太いバンドが見えないなら、westernしてでも確認するべきでは？ > 目的のバンドがまったくないわけではないのですがほとんど溶出できていませんでした。 　ゲルには結合しているけど、溶出していないとする根拠は？　溶出できなかったというのは、ゲルごとボイルして電気泳動して確認したのか？溶出条件（グルタチオンの濃度とか）を検討しましたか？

融合タンパクがうまく精製できないです 削除/引用 No.906-1 - 2009/07/22 (水) 20:18:57 - kor 現在、あるタンパクのC末端領域だけにGSTをつけて融合タンパクをつくろうとしています。 BL21 codon (+)株に形質転換させた後、生えてきたコロニーを前培養→本培養し、IPTGで転写誘導をかける。培養後、菌体を回収してソニケーション。可溶画分と不溶画分とに分けてCBBでバンドを見てみるとどちらにもはっきりとしたバンドがあるのかよくわからない。そこで可溶画分から溶出させてみたのですが、目的のバンドがまったくないわけではないのですがほとんど溶出できていませんでした。私はまったく発現されないわけではないけど、何らかの理由があって精製ができないのかなと解釈しているところです。 乱文で伝わりにくいと思いますが、融合タンパクがうまく精製できない場合、菌体にとって毒性である、タンパクが急速に分解されてしまうなどの理由が考えられるのでしょうか？

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