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遅くなりました。 削除/引用 No.904-12 - 2009/07/30 (木) 15:22:07 - GFP初心者 　遅くなりまして、本当に申し訳ありませんでした。 　他業務に追われ、全く実験が進んでおりませんでした。 　多くのご助言を頂き、誠にありがとうございました。 　確かに、FACSを用いてT細胞に対して抗CD4、8、11c抗体で免疫染色し 　測定する方法が一番なのかと思います。 　早速、抗ラットCD4、8、11c抗体を購入しFACSを行いたいと思います。 DAPI染色は早速、本日試させて頂きました。 　リンパ節から採取し、染色したところ比較的に綺麗にDAPIの青と 　GFPの緑を呈しました。しかし、やはり全ての同形態の細胞が 　GFPの発光を呈しているわけではなく、発光を呈さない細胞も 　多く存在するようです。 　 　色々なご助言を頂き、誠にありがとうございました。 　今後も試行錯誤して、行っていきたいと思います。 　説明不足やリアルタイムでの返信ができずで 　本当に申し訳ありませんでした。

遅くなりましてすいません。 削除/引用 No.904-11 - 2009/07/30 (木) 15:02:15 - GFP初心者

(無題) 削除/引用 No.904-10 - 2009/07/25 (土) 12:07:56 - cDNA Tリンパ球と樹状細胞とターゲットが決まっているなら、脾臓やリンパ節を採取してCD4, CD8, CD11c抗体-PE/APCなどで染め、GFPがポジティブかを調べるのが常法と思われます。 ラットもヒトやマウスとマーカーが同じか良く知りませんが。。。

(無題) 削除/引用 No.904-9 - 2009/07/25 (土) 00:47:46 - Tb > 私は主にTリンパ球と樹状細胞を用いている実験系であり、同細胞がGFPを発現しているかが一番の問題になりました。 リンパ球といえば普通に考えてFACSなんじゃないですか？FACSで検出されなければ発現していないと言い切ってしまっていいと思います。

(無題) 削除/引用 No.904-8 - 2009/07/24 (金) 21:19:19 - CJ やはりあまりよくわからないのですが、明視野染色をレーザー顕微鏡で観察するのは極めてトリッキーです。あと、多重染色には向きません。 つうことで、おそらく最善の手は ＤＡＰＩで核染色：これで組織構築が大体わかる ＣＤ抗体とＧＦＰ抗体で蛍光免疫2重染色 でしょうかね。 これとは別にＧＦＰをＤＡＢか何かで染色して、ヘマトキシリンか何かで対比染色しておいた明視野標本を用意しておく、というのはとてもよい案です。

(無題) 削除/引用 No.904-7 - 2009/07/24 (金) 18:35:54 - あべちゃん 、 > 　可能であれば明視野で細胞を同定し＋共焦点レーザー顕微鏡下でGFP発現を確 > 　認できないかと思い質問をさせて頂きました。 > これは、CJさんが説明して下さった理由により、GFPの蛍光は観察できないですよね。 なので、抗GFP抗体と同時に、例えば抗CD4抗体を用いて、二重染色すればいいのではないですか？ これも、CJさんの意見の重複になりますが・・・

GFP陽性細胞 削除/引用 No.904-6 - 2009/07/24 (金) 17:53:32 - GFP初心者 　本当に申し訳ありません。 　かなり、言葉足らずでした。 　私は主にTリンパ球と樹状細胞を用いている実験系であり、 　同細胞がGFPを発現しているかが一番の問題になりました。 　そこで、まずTリンパ球と樹状細胞を同定し、 　それらの細胞がGFPを発現しているかどうかを 　どのように確認するべきなのかを考えていました。 　Tリンパ球および樹状細胞に特異的な抗体（CD4、CD8等）を用いて 　免疫染色すれば同定可能かと思っているのですが、 　可能であれば明視野で細胞を同定し＋共焦点レーザー顕微鏡下でGFP発現を確 　認できないかと思い質問をさせて頂きました。 　よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.904-5 - 2009/07/23 (木) 22:10:36 - CJ よくわからないのですが、 ＧＦＰ抗体で細胞を染めるのですか？ それとも細胞種特異的抗体で細胞を染めるのですか？ 私の最初の理解ではＨＥで組織の特徴をつかんでＧＦＰ陽性細胞がどの細胞種であるかつかむのだと思いましたが。 細胞種特異的抗体とＧＦＰとの蛍光2重免疫染色で最終的にＧＦＰ陽性細胞がどの細胞種に当たるか同定できるかもしれませんが、そのためにはどの細胞種がＧＦＰを発現するのかあたりをつける必要があります。

御教授ありがとうございます。 削除/引用 No.904-4 - 2009/07/23 (木) 18:16:52 - GFP初心者 　御教授、ありがとうございます。 　なんとか明視野顕微鏡での細胞の同定をしたいと考えていたのですが、 　やはり細胞それぞれに特異的な抗体を用いて免疫染色をしたいと思います。 　 　引き続き、御教授頂ければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.904-3 - 2009/07/22 (水) 22:29:17 - おお わたしも免疫染色に一票

(無題) 削除/引用 No.904-2 - 2009/07/22 (水) 22:16:19 - CJ ＧＦＰが発現しなくなるのではなく、蛍光が消失するのだと思います。 ＧＦＰの蛍光はたんぱく質の立体構造に由来しているので、たんぱく質が変性する条件で蛍光は消えます。加熱、脱水、透徹など。 ヘマトキシリンなどで対比染色する、ということは明視野顕微鏡での観察をしたいのだと思います。でしたら、ＧＦＰに対する免疫組織化学を行って、ＤＡＢか何かで永久染色するのがベストですね。うまく行ったスライドは何年でも常温で持つので気軽に観察できてとても便利です。

GFPトランスジェニックラットの細胞同定法 削除/引用 No.904-1 - 2009/07/22 (水) 17:31:30 - GFP初心者 　 　いつも大変に参考にさせて頂いており、 　初めてトピックを作成させて頂きました。 　基礎実験自体が初心者です。 　 　6月より初めてGFPトランスジェニックラットを 　用いた実験をしています。 　まず、どの細胞にGFPが発現しているかを確認したいと思い、 　メイ･ギムザ染色やヘマトキシリン染色やらを試しているのですが、 　染色をしてしまうとGFPが発現しなくなってしまい、 　細胞の同定ができません。 　いい方法がございましたら、御教授頂ければ嬉しいです。 　よろしくお願い申し上げます。

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