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ご指摘ありがとうございます。 削除/引用 No.9-11 - 2009/02/12 (木) 12:22:53 - ゆんたく 皆様、さまざまなご指摘ありがとうございます。 私はタンパク質を扱ったことがほとんど無く、知識不足なためご迷惑をお掛けしますが、ご容赦いただきたいと思います。 >このような場合はサンプルバッファのBPB(pH指示薬)の色の変化で すぐにわかりますので、Tris(pH8.8)などを微量添加してpHを アルカリ側に戻すとペレットを懸濁しやすくなります。 通りすがり様ありがとうございます。 現在キットを使用した抽出法を先行して行っているため、まだ試せておりませんが、後々検討したいと思います。ただ、ここのラボには超音波破砕機がないかもしれません。 >やはりPVPP使っているようです。 genji様ありがとうございます。 抽出時にPVP(ポリビニルピロリドン）を1.5%添加しています。 また、ご指摘のkitの説明書の記述を確認しました。ので、kitでもPVP1.5%添加で抽出を行いSDS-PAGEを行ったのですが、バンドがあまり見えず、スマイリングも起こってしまいました。タンパク濃度を今までしっかり測定していなかったので、現在BCAキットで測定中です。 >ゲル濾過じゃなくて、疎水性相互作用クロマトはどうでしょうか？ これなら、脱塩と濃縮をワンステップで行えて効率的です。 EcoRI様ありがとうございます。 疎水性相互作用クロマトは検討したいと思います。 今回使用したゲルろ過カラムはGEのPD MidiTrap G-25です。 >TCAのあとエーテルでよくあらって酸性を中和してみたらいかがですか？ 黄色様ありがとうございます。 まだ行っていないので、検討させていただきます。 今後ともよろしくおねがいいたします。

(無題) 削除/引用 No.9-10 - 2009/02/11 (水) 15:05:35 - EcoRI >しかし、Tris buf抽出液の硫安沈殿では抽出効率が悪く試料を多く必要とし、また、塩を除去するためゲルろ過の手順が増えるため、他の方法を検討中です。 もしクロマトを検討するなら ゲル濾過じゃなくて、疎水性相互作用クロマトはどうでしょうか？ これなら、脱塩と濃縮をワンステップで行えて効率的です。

(無題) 削除/引用 No.9-9 - 2009/02/11 (水) 05:32:18 - 黄色 もちろん、いろいろ試されて解けないのでしょうけど、、、TCAのあとエーテルでよくあらって酸性を中和してみたらいかがですか？やってなかったら。 SDSサンプル溶解液中のBPBが黄色くなるようではだめです。

(無題) 削除/引用 No.9-8 - 2009/02/11 (水) 00:12:56 - genji ＞でも、こんな面倒くさいのは嫌ですよね。 ホモジェナイズした後に遠心分離してみたらどうでしょうか。 下層にタンパク質が落ちて、上層にpolyphenolがきます。 （これでもある程度のpolyphenolが下層に残りますが） 多くの論文でこのようなステップを踏んでいるはずです。 よく読んでませんでした。 TCAとアセトンでだめだったんですよね。。。

(無題) 削除/引用 No.9-7 - 2009/02/11 (水) 00:05:43 - genji あ、polyphenol除去方法がkitの資料に書いてあるじゃないですか。 やはりPVPP使っているようです。 http://www.piercenet.com/files/1771as4.pdf ひとつかましてみるのもよいかもしれません。 ちなみにFolin Denisで簡易的にpolyphenol量がわかります。 参考までに。

(無題) 削除/引用 No.9-6 - 2009/02/10 (火) 23:54:12 - genji ＞イチゴの実からタンパク質を抽出して ほとんどタンパク質は含まれていないと思います。 水分が80％以上あるのでは？ と思いますので、ジューサー（ミキサー）で適当にホモジェナイズして、凍結乾燥してから次のステップを行ったらいかがでしょうか。 ホウノキの果実から抽出した時はこのように行っていました。 ＞イチゴは酸性が強いようで ポリフェノール（oligomeric proanthocyanidin)が多いので、pHは酸性にシフトします。 sample bufferが黄変するのはこれが原因です。 polyphenolとタンパク質が不可逆的にからみあいますので、polyphenolをどこかで除去しなければいけません。 そうしなければ電気泳動にも影響するでしょう。 HP(High Powder)かPVPPカラムで処理するとpolyphenolなどがごっそり吸着します。 polyphenolの影響を除くのであれば、面倒ですがカラムを通すことを第一選択に考えます。 でも、こんな面倒くさいのは嫌ですよね。 ホモジェナイズした後に遠心分離してみたらどうでしょうか。 下層にタンパク質が落ちて、上層にpolyphenolがきます。 （これでもある程度のpolyphenolが下層に残りますが） 多くの論文でこのようなステップを踏んでいるはずです。

(無題) 削除/引用 No.9-5 - 2009/02/10 (火) 21:19:26 - 通りすがり 普段、TCA・冷アセトン法で培養細胞からサンプルを作成している者です。 イチゴの実についても同じことが当てはまるかどうかはわかりませんが、 参考までに書き込んでおきます。 この方法ではアセトンを除いた後でペレットをSDS サンプルバッファに 溶かすと思いますが、うちの研究室の系では、アセトンを丁寧に 除きすぎるとサンプルバッファへ溶けにくくなります。 (よって定法にあるような風乾のステップは行わないことにしています。) 逆にアセトン処理をしなかったり、TCAを含んだアセトンが残りすぎて いると、残留したTCAによってサンプルバッファのpHが酸性側に傾き、 ペレットが溶けにくくなる印象があります。 この傾向は、TCAやアセトンのボリュームに対してペレットの ボリュームが相対的に大きい場合に特に顕著です。 このような場合はサンプルバッファのBPB(pH指示薬)の色の変化で すぐにわかりますので、Tris(pH8.8)などを微量添加してpHを アルカリ側に戻すとペレットを懸濁しやすくなります。 ゆんたくさんのおっしゃっている、「サンプルバッファー(BPB)が 黄色く変色」するというのがもしこの段階をさしているようでしたら、 pHを戻すだけでうまく懸濁できるかもしれません。 うちの研究室の系では、これらのことに注意しても、vortexに数分 かける程度ではペレットをうまく懸濁できないので、水槽式の 超音波破砕器を常用しています。 (懸濁と同時にDNAの切断もできて便利です)。 長文失礼いたしました。

(無題) 削除/引用 No.9-2 - 2009/02/10 (火) 20:39:32 - EcoRI イチゴの実をそのまま、20%ぐらいの冷TCAとともにホモジナイズして、 通常のTCA沈殿を行って、 ペレットを少量のSDS-サンプルバッファーに溶かします。 (もちろん、ペレットが溶けるような量が必要ですが) これを初発サンプルとして、希釈系列を作っていくのはどうでしょうか？ これだと、pHの問題も回避できます。 それでも、抽出効率が悪ければ、 Urea/Triton/CHAPSなどの変性剤を用いるのがいいかと思います。

イチゴのタンパク抽出 削除/引用 No.9-1 - 2009/02/10 (火) 20:13:33 - ゆんたく はじめて書き込みいたします。 よろしくお願いします。 早速ですが、イチゴの実からタンパク質を抽出してSDS-PAGEと2-Dを行いたいと思っています。そこで適切な抽出法またはキットはないでしょうか？ まず現段階では、タンパク質の抽出法の検討をしています。 目標は、SDS-PAGEで１レーンに30μlアプライし泳動したゲルをCBB染色で多くのバンドが確認できる濃度を得られることです。 抽出キットはpierceのP-perを使用しています。 キットを使用すると、目的の濃度を得ることが出来ますが、少々高価なので他キットも調査しています。 また、キットの他にTris bufで抽出した上清を硫安沈殿で濃縮することにより、目的の濃度を得ることが出来ています。 しかし、Tris buf抽出液の硫安沈殿では抽出効率が悪く試料を多く必要とし、また、塩を除去するためゲルろ過の手順が増えるため、他の方法を検討中です。 TCA・冷アセトンでの抽出は試しましたが、得られたペレットが再溶解しませんでした。 また、フェノールは使用しない系を考えるようにと言われています。 イチゴは酸性が強いようで、サンプルバッファー(BPB)が黄色く変色します。このあたりも改善の必要があると考えています。この酸性状態がタンパク抽出に影響を与えているのではないかとも危惧しています。 また、硫安沈殿の段階で糖(ペクチン?）と思われる物質が20％飽和程度で析出してきます。これをうまく除去できるカラムなどがあれば教えていただきたいです。 散文申し訳ありませんが、ご助言いただければ幸いです。

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