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＞ＤＤＤ, そば 削除/引用 削除/引用 No.892-19 - 2009/07/25 (土) 19:16:15 - やき ＞ＤＤＤ 浸透圧ですか・・そのことは考えませでした。 しかし、原因はComplex・Opti-MEM・手技のどれかと思ったので この週末に、Opti-MEMでwashするときに、アスピレーターも８連ピペットも使わずに １wellごとにピペットでやっていたら、改善されました！！ コメントありがとうございます。 ＞そば まさしく、その状態だったのです！ 最初はComplexが調整時にわずかに白濁するので、それが原因かと思ったのですが 染色したところ、やはり細胞の「減少」が確認されたので・・ 原因はComplex・Opti-MEM・手技のどれかということにもどってきてしまい・・ 再検討を行った結果、Opti-MEMでの洗浄(８連ピペット)ということに的をしぼり 週末に、やり直してみたところ、改善されたので・・解決いたしました！！ コメントありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.892-17 - 2009/07/24 (金) 01:27:08 - そば ちょっとした思い出話になりますが。 ある学生君が「96well plateにトランスフェクションをしたら細胞が消えた」と大騒ぎ。トピ主さんと全く同様に、トランスフェクション試薬を加えた直後に細胞が消えて無くなると言っていました。 私も実際にトランスフェクション試薬を加える前と後で見比べて見たのですが、確かに細胞が”消えたように見える”。 だけどよ〜く見ると、細胞はきちんと張り付いていました。 その時の原因は非常に簡単で、ある種のトランスフェクション試薬を培養液に加えると培養液が僅かに濁るんですね。その濁りによって位相差の掛かりが悪くなり、まるで細胞が消えたように見える・・・と。 念のため、トランスフェクション直後の細胞をPBSで洗浄してから顕微鏡で見てみると、やっぱりきちんと張り付いている。 トランスフェクション試薬を加えたまま、細胞を染色してみるときちんと染まる（その時はDAPIを加えて洗浄後、UVトランスイルミネーターで蛍光観察） ということで、その時は ・トランスフェクション試薬の添加によって発生した濁りによる位相差のずれ ・96well plateを用いた際の狭い視野（中央部しか位相差かかりませんから） ・用いていた細胞が薄く広がるタイプで、もともと見えにくい細胞だった という3つの要因で”細胞が消える事件”が起こっていました。 トピ主さんのお話を聞いていたらなんとなく思い出してみたのですが。 細胞がいるかいないかを顕微鏡観察のみで判断するのではなく、細胞を染色してみたら如何でしょうか？ それでも細胞が消えているようであれば、不思議ですけどねぇ・・・

浸透圧 削除/引用 No.892-16 - 2009/07/22 (水) 13:39:46 - DDD Complexありで細胞がいなくなり Complexなしで細胞は残ったまま Complexで浸透圧が変化してるとか？まぁないかな…。 細胞がすぐに居なくなるって、PBSと間違えて水を添加しちゃった 時と似てますね…。

＞Ｒ 削除/引用 No.892-15 - 2009/07/22 (水) 13:04:19 - やき ＞mediumを入れて見ているときと 　導入試薬のcomplexを入れてみているときとで 　well内のvolumeは同じですか？ 同じです。 100μl/wellで培養、処置をして、見ています。

(無題) 削除/引用 No.892-14 - 2009/07/22 (水) 11:00:41 - mom-a 洗浄や培地交換時に冷たいmediumを使うと細胞によってかなり剥がれやすいものがあります。

(無題) 削除/引用 No.892-13 - 2009/07/22 (水) 10:54:56 - R mediumを入れて見ているときと 導入試薬のcomplexを入れてみているときとで well内のvolumeは同じですか？

(無題) 削除/引用 No.892-12 - 2009/07/22 (水) 10:52:52 - み >[Re:11] やきさんは書きました : > もう一度明日、24hr処置後の96well内を確認してみます。 > 前回は72hrまで待ってみたのですが、そこでやっと壁に残っていた細胞が少し増殖し増えたぐらいで > やはり、その時もあきらかな細胞の減少が確認されたので > > ３回目の今回が駄目なら > 計画を練り直して、改善・改良点をしっかり考えて、やり直します。 > 24, 72h待つ意味が分からないです。 添加直後に減少しているのでしょ。 文面から判断すると剥がれて一旦、浮いた細胞が再度付着して増えている？ コラーゲンやリジンコートで細胞まいておいて改善されるなら「剥がれ」が原因でしょう。

＞う 削除/引用 No.892-11 - 2009/07/22 (水) 00:27:03 - やき 影も形も消えてなくなるというのは、確かに大げさすぎるかもしれませんが 添加前を100%とするなら、80%以上は減ってしまっているように見えるので・・ すみませんでした。 もう一度明日、24hr処置後の96well内を確認してみます。 前回は72hrまで待ってみたのですが、そこでやっと壁に残っていた細胞が少し増殖し増えたぐらいで やはり、その時もあきらかな細胞の減少が確認されたので ３回目の今回が駄目なら 計画を練り直して、改善・改良点をしっかり考えて、やり直します。 アドバイス、ありがとうございました。

＞ＴＳ 削除/引用 No.892-10 - 2009/07/22 (水) 00:18:11 - やき ＞単純に溶液を加えるときの勢いで剥がれているだけだと思いますよ。 ＞遺伝子導入試薬なしの洗浄操作だけで、細胞が消えちゃうんじゃないでしょうか？それって確認していますか？ 私も手技(洗浄wash)の勢いでいなくなってしまっているのだと思い PS＋のMediumですが、同じように洗浄をして、Mediumを入れななおして確認してみたのですが その時は、ちゃんといるのです。 これが、私が一番悩んでいるところです。 ここでいなくなっているのであれば、洗浄時の勢いのせいだと結論づけて完結できるのですが・・ この場合いるので・・。。 一度、Opti-MEMでの洗浄をやめてPBS-での洗浄に切り替えてみるか 洗浄をやめて、直接Complexを添加するか、一度こちらの方向も検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.892-9 - 2009/07/22 (水) 00:11:04 - う そもそも、「消えてなくなる」という言い回し自体意味が分からないのは誰しもそうだと思います。 単純に「消えてなくなるわけないのだから、ちゃんと観察しろ」ってことを 言葉を変えて言っているだけです。

うーんと 削除/引用 No.892-8 - 2009/07/22 (水) 00:06:09 - TS 96well plateは、基本的に位相差顕微鏡でも細胞は見にくいですからねぇ。 Wellの中心くらいしかよく見えませんよね。 単純に溶液を加えるときの勢いで剥がれているだけだと思いますよ。 いろいろ議論されてますけど、理論的にこれしかないでしょう。 遺伝子導入試薬なしの洗浄操作だけで、細胞が消えちゃうんじゃないでしょうか？それって確認していますか？ 6Wellで成功している、トランスフェクションのスケールダウンでしょうし、試薬濃度が高すぎで溶かしているっていうのは、あまりにも稚拙すぎるミスで考えにくいと思います。（でも、一応再確認してくださいね） 細胞が消えてなくなるはずないしねぇ。

＞み 削除/引用 No.892-7 - 2009/07/21 (火) 22:59:44 - やき ＞リポフェクション含有mediumを細胞に添加する時に、勢い良く細胞に降りかかり、細胞が溶けているのでは・・・。 添加直後の観察で、すでに細胞の減少が確認されるのですが そんなにすぐに溶けてしまうものなのでしょうか？？ やはり、「勢い」とかも大きく影響するのでしょうか・・。 一応壁を伝わらせて、細胞が接着している底に直撃しないようにはしているのですが。 (あと、Lipofectamineではなく、Oligofectamineを使用しています)

＞う、み 削除/引用 No.892-6 - 2009/07/21 (火) 22:54:47 - やき ＞溶液を入れた直後に居なくなる？ 　陰も形もなくなるということでしょうか？ 　それとも浮いている細胞は見受けられるということでしょうか？ いえ、影も形もです・・ おっしゃられるようにcomplexの細胞毒性が細胞の接着能をなくしているのであれば 細胞が浮いていたりしているのが見られると思うのですが 浮いている細胞も、いないので・・その可能性はないのかなとかんがえています。 ただ、「み」さんに書き込んでいただいたコメントにあるように 細胞が溶けてしまっているのであれば、話は別ですが それでも、添加してすぐに顕微鏡を覗き込んでいないということに謎がのこります。 (そんなにすぐ溶けてしまうとは、考えられるのでしょうか・・) ＞６wellで加えた液の量と比較して、９６wellに加えている液の量は相対的に多いとか。 今コメントしていただき、もう一度確認してみようと思いました。 OlitofectamineとsiRNAの濃度(量)は、Oligofectamineに添付されていた プロトコールに従ってスケールダウンして添加しましたが・・ 明日、もう一度プロトコールの確認を念入りにして計算・確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.892-5 - 2009/07/21 (火) 18:27:57 - み リポフェクション含有mediumを細胞に添加する時に、勢い良く細胞に降りかかり、細胞が溶けているのでは・・・。

(無題) 削除/引用 No.892-4 - 2009/07/21 (火) 18:06:55 - う 溶液を入れた直後に居なくなる？ 陰も形もなくなるということでしょうか？ それとも浮いている細胞は見受けられるということでしょうか？ Complex、もしくはそれを含んだ溶液が、細胞に対してかなりの毒性を持っているということでは？ ６wellで加えた液の量と比較して ９６wellに加えている液の量は相対的に多いとか。

＞う 削除/引用 No.892-3 - 2009/07/21 (火) 16:33:06 - やき ＞「添加した後」とは、添加してからどのくらいの時間を言っているのですか？ ＞添加してしばらくの間、20〜３０分間、見続けたことありますか？ 添加した後＝添加直後です。 その４時間後にもMedium changeするのですが、その時点でもほとんどいないのです。 なので、この間はインキュベーターに入れたままなので、添加後20〜30分後は見ていません。 ＞細胞は付着ですか、浮遊ですか？ 細胞のことにまったく触れずに申し訳ありませんでした。 接着細胞です。 腎癌細胞のACHN, Caki-2, 786-o の３種類です。 この３種とも、いなくなってしまっているので・・ 細胞のせいとは考えられず、他の方向で考えています。

(無題) 削除/引用 No.892-2 - 2009/07/21 (火) 14:15:50 - う >添加する前に顕微鏡で見る限りは細胞がいるのに 添加した後に顕微鏡で見ると細胞がいなくなるのです 「添加した後」とは、添加してからどのくらいの時間を言っているのですか？ 添加してしばらくの間、20〜３０分間、見続けたことありますか？ あと、細胞は付着ですか、浮遊ですか？

96wellでsiRNA処置をした際の細胞の減少について 削除/引用 No.892-1 - 2009/07/21 (火) 11:42:39 - やき 96welに細胞をps-(ペニシリン・ストレプトマイシン−)のMediumで播種し 24hr後にOligofectaminesi,Opti-MEM,siRNAのComplexを作成して処置するのですが Complexを添加する前に、Opti-MEMで１度洗浄してから（血清あり→血清なしへ)添加するのですが 添加する前に顕微鏡で見る限りは細胞がいるのに 添加した後に顕微鏡で見ると細胞がいなくなるのです アスピレーターにパスツールピペットを付けて96wellからMediumを除去しているのですが それが原因かと思い、継代の際に(ps＋ですが)同じように播いてMedium Changeを２回してみたのですが(Complex処置なし) その時にはちゃんとMedium Changeの前と後で細胞はいるのです この２点から、アスピレーターで吸うときの手技に問題があるわけでもなく Medium Changeの際の手技の問題もないとは思うのです・・ あと、強いていうならPS-とPS＋の違いかと思うのですが これは担当教授に聞いてみたところ関係ないとの見解を示していただきました 6well palteで以前実験したときは、とくに細胞が劇的にいなくなるというわけでもなく 何も違和感はなかったのですが、あまりの減り様に驚愕しております。 もし、何かお気づきの点や考えられる点がありましたら 助言いただけるとうれしいです、お願いいたします。

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