とも様、in situ様、ありがとうございます。
＞サイバーグリーンでどのように定量しようとしているのですか？
レンチウイルスの２つのLTRの間の領域にプライマーを作成し、感染後４日目の細胞からゲノムDNAを抽出し、細胞内在性のPGK1遺伝子を内部標準として、ウイルスの配列の相対コピー数を定量しています。一応MOI（本来のMOIとは厳密には異なるようですが・・・）を出すために、MOIスタンダードなるものを用意して（細胞数をカウントして、1細胞あたり2nプラスミドとなるようにして、細胞溶解液に加え、それからDNA抽出したものです。nを変えて検量線を書き、実際のサンプルのデータからMOIを計算します。）MOIスタンダードを作成した理由が、セルライン毎にゲノムの歪みが異なるため、PGK1遺伝子のコピー数にばらつきがあるのではないかと思ったためです。ですからセルライン毎にMOIスタンダードを作っています。
＞あとレンチウイルスを作る時にウイルスはDNase処理をしていますか？？処理しないとプラスミドのコンタミがみられますよ。
そうですね。そのことを考慮して、参考にしたSBI社のキットのマニュアルにも洗浄をしっかりせよと書いてあります。ただ実際にやってみると293T細胞があまりに剥がれやすいため、十分な洗浄はできません。ただ感染後もアッセイまでに結構な回数の培地交換をしているため、プラスミドの問題は恐らくないのではと考えています。実際、遺伝子導入試薬を使わない場合にMOIを定量するとすごく小さい値でした。ただDNase処理するというのは考えたことはあったのですが、実際にやられている方法とは知りませんでした。もし差し支えないようでしたら、具体的な手順等も教えていただけませんでしょうか？
＞プラスミドのコンタミはないというのにはネガコンとして熱処理したウイルスを感染させるとよいです。
なるほど、良いコントロールですね。やったことはありませんが、今度試してみようかと思います。実際にどのくらいの温度で、どのくらいの時間熱処理すれば良いのでしょうか？
＞融解曲線はチェックされましたか？
はい、問題なかったです。
＞あと、テンプレートの代わりに水を入れたものをNTCと呼んでいるので、間違いはないですよね？
はい、おっしゃるとおりです。
＞残るは試薬のコンタミとかでしょうか。
そうですね。その可能性はあるのですが、６本すべてというのがちょっと解せなくて・・・。もしかして、primer expressで作るとTaqman仕様になって、Sybrでは具合悪いことがあるのかなあ？なんて妄想しています。もしかしたら内部プローブで検出するため、多少の3'compatibilityは無視するアルゴリズムであるとか・・・。 |
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