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(無題) 削除/引用 No.887-5 - 2009/08/07 (金) 20:58:43 - rose ご指摘有難うございます。 PARP-1-KO-MEFを使用しています。ですので、他のPARP familyによるPAR化は否定できないのですが、PARP-1-KO-MEFに非選択的PARP阻害剤（3-AB）を処置しても、（非特異的と思っている）バンドが検出されます。最近はPARP familyも多く報告されており、3-ABで阻害されないタイプもあるのかもしれませんが、かなりメジャーなバンドとして検出されるので、WBのプロセス（特にブロッキング）に問題点を感じている次第です。

(無題) 削除/引用 No.887-4 - 2009/08/06 (木) 17:02:40 - removed PARP-KO-MEFとはPARP１KO-MEFですか？ PARが検出されるのは他のPARPファミリーの効果である可能性があるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.887-3 - 2009/08/06 (木) 14:12:32 - rose お返事大変遅れて申し訳ありませんでした。ご回答をありがとうございます。 これは大変スマートな方法だと私も思い実施経験があるのですが、ご指摘のようにPARGの良い阻害剤がないため（加えて市販PARG阻害剤が高価なので）、核に分画する工程でPARの分解が生じ、シグナルは検出できませんでした。 ＞ポリADPリボシル化を受ける蛋白質の多くは核タンパク質と思いますので、とりあえず細胞質と核に分画してそれぞれの画分についてWBしたらいかがでしょうか。量的に少ないものだと、ホールライゼートでは量の多い蛋白質が割合的に多くを占めるためみえなくなるかもしれないので。プラス荷電の強い塩基性蛋白質は転写されにくいですが、マイナス荷電が増えるぶんには、転写効率の点ではあまり大きな障害にはならないようにおもいます。 あとPARGのインヒビターを知らないのですがもしそういったものがあるならば、それを細胞溶解液に添加した方がいいでしょう。 現在、バンクに問い合わせ中です。有用な情報を有難うございました。 ＞10Hについては細胞バンクにこの抗体を産生するハイブリドーマがあったと思います。今後の使用量によっては検討されてはいかがでしょうか。 その後、PARP-KO-MEFでアルキル化剤処理でPARの検出をWBで実施してみたのですが、やはり非特異的と思われる（WT-MEFでも同量、同程度検出される）バンドが検出されます。WT-MEFではPARPの自己修飾が特異的に検出できてますので、おそらくWBの手技（特にブロッキング）に問題があると思います。ブロッキング剤も様々ですが、スキム、カゼイン系、BSAは試しましたが、カゼイン系（Blocking One）が一番マシでした。他のブロッキング剤でお勧めがあればご教示下ると助かります。 また有用な情報がございましたら、よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.887-2 - 2009/07/20 (月) 16:05:22 - C ポリADPリボシル化を受ける蛋白質の多くは核タンパク質と思いますので、とりあえず細胞質と核に分画してそれぞれの画分についてWBしたらいかがでしょうか。量的に少ないものだと、ホールライゼートでは量の多い蛋白質が割合的に多くを占めるためみえなくなるかもしれないので。プラス荷電の強い塩基性蛋白質は転写されにくいですが、マイナス荷電が増えるぶんには、転写効率の点ではあまり大きな障害にはならないようにおもいます。 あとPARGのインヒビターを知らないのですがもしそういったものがあるならば、それを細胞溶解液に添加した方がいいでしょう。 10Hについては細胞バンクにこの抗体を産生するハイブリドーマがあったと思います。今後の使用量によっては検討されてはいかがでしょうか。 定常状態でもポリADPリボシル化されているものもあると思うので、コントロールでも少しは見えるのはかならずしも変ではないと思います。 HeLa細胞など他のよく使われる細胞でもみてみるとか、UVとかH2O2など他のDNA傷害刺激でもも見てみたらどうでしょうか。一般的に考えるとADPリボシル化はDNA傷害後、非常に初期に起こる反応ではないかと思いますが、細胞や刺激の種類や強度でも違うと思うので、DNA修復の過程でどこかにピークが来るかもしれないので、刺激後のタイムコースや刺激の強度も何点かとってみる必要があるかもしれません。

ポリADPリボシル化のWB 削除/引用 No.887-1 - 2009/07/19 (日) 16:03:57 - rose いつもお世話になっております。 皆様の中にポリADPリボシル化（PAR化）の解析をご専門にされている方はいらっしゃいますか。特にwhole cell lysateを用いたWBですが、他論文で実施されているようなPAR化蛋白質のWB、つまり、アルキル化剤や酸化ストレスでPARPを活性化させてPAR化を惹起した細胞のcell lysateを使ってWBとは、いまひとつ同じような結果になりません。詳細に言えば、私どもの結果ではSN比が悪いのです。無刺激でもバンドは見えますし、刺激でバンドは増えるのですが、既報のパターンとは明らかにことなり、しかも劇的とは言えません。既報では、コントロールでは全くPAR化は認められず、刺激で劇的なPAR化蛋白質増加（これは低〜高分子まで一様にです）認められてます。PARは非常に分解を受けやすいので刺激後のサンプル回収はサンプルバッファーを直接入れ、すぐにボイルしてます（既報と同じです）。PRRはmassiveなマイナスチャージですので、WBのトランスファーにややコツがいるのかなという気がしていますが同じような経験をされた方はいらっしゃいますか？ 因みに使用抗体はアレキス社の10H（マウスモノクロ）とBIOMOLのLP96-10-4（ウサギポリクロ）です。転写膜はニトロ、ブロッキングはブロックエースまたはブロッキングワン、更に5％BSAやスキムもためしましたが、ブロッキングワンが一番効果がありました。どなたか、特に神経系細胞株（SH-SY5Yなど）でご経験のおありの方、コメント頂ければ幸いです。

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