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(無題) 削除/引用 No.882-6 - 2009/07/23 (木) 16:30:26 - mom-a ＞短い時間で４℃の方が細胞へのストレスは少なくないですか？ ストレスの定義によるのではないでしょうか。「低温」や「温度変化」もある種のストレスでしょう。 （私はFicollを使っていましたが）温度を下げるなというのには理由があり、Ficollの密度が変化してしまうからです。4℃と室温（私は20℃に設定していましたが）では回収率や得られた細胞のポピュレーションが異なる可能性があります。 そのあたりを考慮した上で、最終的にはうさんのおっしゃるように ＞もし、増えたのなら、ストレスを取るか、回収率を取るか 妥協点を見つけるしかないと思います。 末梢血、骨髄、さい帯血、などそれぞれ分離の良さには違いがありますので、（末梢血が一番きれいに分離できると思います）ある程度は仕方ないのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.882-5 - 2009/07/23 (木) 15:56:51 - う ＞EDTA1mM添加してやったところ、クラスターはなくなりましたが、 このとき、回収率は増えたのですか？ もし、増えたのなら、ストレスを取るか、回収率を取るか で考えてはダメなのでしょうか？ そもそも、「細胞に対するストレス」という抽象的な雰囲気をおっしゃっていますが、 それはどうも独りよがりの思い込みな気がするのですが、 実際、ミトコンドリアの染色に影響があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.882-4 - 2009/07/23 (木) 15:53:52 - う >遠心管の壁にクラスターがどうしても付いてしまい 付いているのはわかりました。 ＞回収率が落ちているような気がします。 この根拠は？

(無題) 削除/引用 No.882-3 - 2009/07/23 (木) 13:54:36 - masa 短い時間で４℃の方が細胞へのストレスは少なくないですか？ 実際、血液でやった場合きれいに問題なく採れます。しかし、骨髄の場合説明書通りでやっても、細胞の固まりが遠心管の壁にこびりつきどうしてもロスが多くなってしまいます。EDTA1mM添加してやったところ、クラスターはなくなりましたが、細胞にストレスがかかりそうな気がします。取ってきた物を使って、ミトコンドリアの染色をする予定なので、なるべく人工的なストレスを避けたいと考えています。FCSも細胞の接着性があがりクラスターの原因になりそうですし何かいい方法は内意かと思ってます。

設定を変えた理由は？ 削除/引用 No.882-2 - 2009/07/23 (木) 12:30:31 - mom-a ＞600G 15分　４℃で遠心しています。 ＞この遠心の設定は、Sigma推奨の設定でないのですが、細胞へのストレスを考慮してこの設定にしています。（室温で３０分の遠心よりさいぼうに保護的？） Sigma推奨の設定を変更したのは何故ですか？ Histopaqueも何種類かあるようですが取り説には下記のように書かれていませんでしたか？ EXACTLY 30 MINUTES at room temperature. Lower temps may cause clumping and poorrecovery.

遠心分離法について 削除/引用 No.882-1 - 2009/07/17 (金) 12:41:39 - masa 骨髄単核球細胞をHistpaqueにて回収しています。 中間層に単核球層ができますが、遠心管の壁にクラスターがどうしても付いてしまい回収率が落ちているような気がします。細胞浮遊液の濃度を薄くしたり、遠心の設定を変えたりしましたがうまくいきません。このクラスターを無くして回収率を上げるにはどうしたらいいでしょうか？ 今やっている方法では、５％HBSS(mg- Ca-)にて髄腔内をフラッシュ。 その後２回洗浄後、ナイロンメッシュに通してdebrisをのぞく。 約６ｍｌのＨＢＳＳにリサス後遠心。 600G 15分　４℃で遠心しています。 この遠心の設定は、Sigma推奨の設定でないのですが、細胞へのストレスを考慮してこの設定にしています。（室温で３０分の遠心よりさいぼうに保護的？） 何かここをこうした方がいいとかありましたらご指摘お願いします。

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