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(無題) 削除/引用 No.878-9 - 2009/07/18 (土) 10:48:39 - KOP 皆様へ 貴重なご意見ありがとうございました。 勉強にもなりました。 頑張ります。

(無題) 削除/引用 No.878-8 - 2009/07/18 (土) 04:07:36 - おお 溶液のチョイスとしては一般的には妥当かと思えます。 ただし、タンパクの抽出はクセのある物があったりして 一般的なバッファーでは抽出しにくいタンパクとかありますので、 文献を数種類当たってみてよく使われているものを 使うのが妥当だと思います。 BCL-2が膜に結合できるタンパクであるのと1% NP-40でほぼ膜は 溶解できることを考えると、ファイナル2mg/ml以下の濃度に なる程度のバッファーを加えてライセートを作っているなら BCLー2に関しては経験がありませんが、このようなタンパクなら 抽出できる可能性はかなり高いです。 どちらにせよスペキュレーションですので文献を当たってみてください。

(無題) 削除/引用 No.878-7 - 2009/07/18 (土) 00:37:37 - ami ＞成液が妥当かどうか不安に思い 妥当だと思います

(無題) 削除/引用 No.878-6 - 2009/07/17 (金) 19:45:06 - C 少量のSDS-sample buffer（10 cm dishで1ないし1.5mlくらい。セルスクレイパーでかき集めながら）で直接、細胞を溶解し、粘性がなくなるまで超音波でDNAを剪断してから、軽く遠心してゴミを除き、泳動サンプルとすればよいと思います。泳動はミニゲルならば、蛋白質量は10μgくらいを真ん中に何点か振ればよいでしょう。存在量が極端に少ない特別な蛋白質でない限りは、ウェスタンでECLなら10-15μgくらい流せば普通は見えます。SDS　sample bufferで全ての蛋白質が確実に抽出できるとは厳密には言い切れないけど、現状では、一番それに近い事が期待できる抽出液とおもいます。 今お使いになっている抽出液の組成はよく使われているものの一つと思いますが、すくなくともクロマチンを構成するような核タンパク質の一部や核マトリクス蛋白質などは溶かせないとおもいます。妥当かどうかは対象とする蛋白質によるので、比較的マイルドな抽出液組成の場合、ある蛋白質で非常にうまく抽出できたから、他のものでも同じ組成でいけるとは限らないし、たとえ抽出できても細胞内分布などの違いで、細胞内にあるその蛋白質の一部だけを抽出してきたものを見ている可能性もあるので、比較的マイルドなものを使う場合は注意が必要です。

(無題) 削除/引用 No.878-5 - 2009/07/17 (金) 18:22:39 - う 液の組成的には、おそらくここを見た方は、大丈夫なんじゃ？と思っていると思います。 しかし、他のファクターはどういう状況なのかおっしゃらないのであるのならば、 バンドが出ないということなら妥当ではないのでしょう。 としか言えませんよ？ 感覚的に、そのバッファーの組成に大問題が無いと思っているけど、 タンパク濃度はどのくらいロードしたのかとか、 論文的に使われている抗体を使用しているとか、 そういうの聞いていないので、第三者は判断しようがないです。 質問されている意味が無いと思いますが。 そんな液の組成の妥当性だけを知りたいのなら、論文などをお調べください。 その方が建設的です。

(無題) 削除/引用 No.878-4 - 2009/07/17 (金) 17:46:27 - KOP タンパク濃度や抗体に関しましては一応検討しております。 ご指摘ありがとうございました。 今回、Bcl-2タンパクの抽出液として、【50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; and proteinase inhibitor cocktail】組成液が妥当かどうか不安に思い、質問させて頂きました。 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.878-3 - 2009/07/17 (金) 12:30:43 - み workする抗体なのか？ 他の抗体（アクチンなど）確実に検出できる抗体を用意する。

(無題) 削除/引用 No.878-2 - 2009/07/17 (金) 11:26:38 - う どのくらいの細胞を溶かしたのか？ タンパク溶液のタンパク質濃度はどのくらいか？ これがわからないと何も言えません。

タンパク抽出 削除/引用 No.878-1 - 2009/07/17 (金) 10:27:53 - KOP いつも勉強させていただいています。 さっそくなのですが質問させていただきます。 現在、ウェスタンで細胞中のBcl-2タンパクの発現を確認しています。 細胞からタンパクを抽出するのに、現在以下のような組成の抽出液を使っています。 【50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; and proteinase inhibitor cocktail】 何か不都合な点がありますでしょうか？ 結果としてはバンドが薄く、きちんとタンパクが抽出できているのか不安に思っています。 私はウェスタン初心者ですので、ご指摘していただければ幸いです。 宜しくお願いします。

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