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二次抗体anti-Goat IgG-HRPのお勧めのメーカーについて トピック削除
No.862-TOPIC - 2009/07/15 (水) 05:46:54 - S
お教え下さい。当方で使用しているサンタクルーズ社の二次抗体、anti-Goat IgG-HRPを用いてウエスタンブロットを行うと、ECL-plusで非常に高いバックグラウンドを発してしまいます。もちろん、二次抗体のみを利用しても、フィルムが黒くなってしまいます。希釈倍率も検討しましたが、一次抗体のバンドが検出しうる希釈倍率での使用はできませんでした。通常のECLなら利用可能なのですが、目的のタンパク質が微量なので、長時間露光反応させたいと考えております。もし、どなたか、ECL-plusで利用可能な尚且つお勧めのanti-Goat IgG-HRPをご存じであれば、是非、メーカーとお教え下さい。何卒宜しくお願い致します。
　
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No.862-9 - 2009/07/18 (土) 07:59:55 - S
結果をお知らせ致します。3% BSAブロッキングで非常にきれいな結果を得ることができました。非常に有用な情報ありがとうございました！！！

(無題) 削除/引用
No.862-8 - 2009/07/16 (木) 01:54:08 - S
皆様、ありがとうございます。目的分子に対する抗体は現在、Goatの抗体しか使用できずに、仕方なくGoatを使用しております。Goatの二次抗体のみがメンブレンが真っ黒になってしまいます。Homersさんのスキムミルクの情報は、確かに私はスキムミルクをブロッキングで使用しておりますので、非常に可能性が高いと思います。是非試してみたいと思います。APさんの、メンブレンの可能性という情報は、他種の二次抗体では非常にきれいな結果がでるので私の場合は当てはまらないと思います。CさんのSheepを使うというのは、すばらしい発想だと思います。可能であれば試してみたいと思います。まずは、BSAブロッキングで試してみます。本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.862-7 - 2009/07/15 (水) 21:37:57 - A
この手の二次抗体を使う時はWB、ELIZAに限らずJackson ImmunoResearchの
抗体を使っています。anti-Goat-IgG-HRPは使ったことありませんがこの
メーカーからいくつかを使って問題になったことは今のところありません。

(無題) 削除/引用
No.862-6 - 2009/07/15 (水) 21:21:30 - Tb
Jackson ImmunoResearchのdonkey anti-goat IgG(H+L) HRPを1:100,000で使ってます。bovineへのクロスはテックシートに書いてないですが、non-fat milkでも問題ありません。

(無題) 削除/引用
No.862-5 - 2009/07/15 (水) 21:11:12 - Homers
メンブレンのブロッキングにスキムミルクを用いると、どうもanti-Goatはこのスキムミルクの何かの成分に反応するらしく、発色によってメンブレン全体が真っ黒になります。そこでブロッキングにBSAを用いたところ改善されました。BSAは1~3%くらいの範囲でやってます。

私はSigmaの二次抗体が好きです。 削除/引用
No.862-4 - 2009/07/15 (水) 21:03:39 - TS
Rabbit anti-goat IgG-HRPを使っています。
希釈倍率は1:100000、検出系はECL-plusです。

anti-sheep　IgGhaいいですよ。 削除/引用
No.862-3 - 2009/07/15 (水) 20:27:12 - C
anti-goat IgG-HRPはバックが高くなりやすいです。場合によっては真っ黒になります。なんでか分からないけどメーカーとか関係なくgoatはそうなります。それでできるだけ1次抗体はgoat は避けるようにしていますが、どうしてもそれしか無いときは、2次抗体にanti-sheep IgG-HRPを使うようにしています。（前に友達に教えてもらった。）そうするとバックは、すごいきれいとまではいかないかもしれないけど、かなり減らすことできます。.

(無題) 削除/引用
No.862-2 - 2009/07/15 (水) 10:01:16 - AP
>もし、どなたか、ECL-plusで利用可能な尚且つお勧めのanti-Goat IgG-HRPをご存じであれば、是非、メーカーとお教え下さい。何卒宜しくお願い致します。
というspecificな情報は、もしあれば他の方にお任せしますが、
一般論として、二次抗体が交差反応して「非特異的なバンドが生じる」というのではなく、「メンブレン全体が黒くなる」ということであれば、抗体の性能の問題ではないと思います。まずブロッキングやメンブレンあたりを検討してみますけれど。

それと化学発光なら、いっそのことHRP標識ではなくECLでもなく、AP標識でCDP-starで検出、これ最強です。そのへんフレキシブルならお試しになっても。内在性のAPが染まってしまう場合がありますけれど。

二次抗体anti-Goat IgG-HRPのお勧めのメーカーについて 削除/引用
No.862-1 - 2009/07/15 (水) 05:46:54 - S
お教え下さい。当方で使用しているサンタクルーズ社の二次抗体、anti-Goat IgG-HRPを用いてウエスタンブロットを行うと、ECL-plusで非常に高いバックグラウンドを発してしまいます。もちろん、二次抗体のみを利用しても、フィルムが黒くなってしまいます。希釈倍率も検討しましたが、一次抗体のバンドが検出しうる希釈倍率での使用はできませんでした。通常のECLなら利用可能なのですが、目的のタンパク質が微量なので、長時間露光反応させたいと考えております。もし、どなたか、ECL-plusで利用可能な尚且つお勧めのanti-Goat IgG-HRPをご存じであれば、是非、メーカーとお教え下さい。何卒宜しくお願い致します。
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