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(無題) 削除/引用 No.861-10 - 2009/07/16 (木) 22:27:38 - マチ 既出ですが、色々と情報が不足しているため何とも判断がつきません。。 溶液無し、というのは、本当にドライアップした状態なのか。 どの程度の感度が欲しいのか。 サンプルの濃度はどの程度と想定されるのか。 等々。 私見ですが、溶液が無いため蛍光が見えていない、あるいはばいやさんの仰る通り単なる検出感度不足である気がします。 なお、定量性(直線性)についてですが、蛍光抗体を用いた場合の方が圧倒的に良好であるのは確かです。ただ、酵素抗体法を使うことで絶対的な検出感度は桁違いに良くなります。 そもそもELISAを使うということは、nM以下の様な低濃度のサンプルを定量したい、という背景があってのことでしょう。 その場合、蛍光抗体で測定するというのはcell-ELISAでもない限り圧倒的に感度不足な気がします。

(無題) 削除/引用 No.861-9 - 2009/07/15 (水) 09:15:10 - ばいや 蛍光抗体を用いているから基質はいらないでしょう。蛍光物質がついているなら。なかには酵素反応で蛍光物質をつくるものもあるのでそこは注意。なんだかあやふやなので大丈夫かなと。 キット名や機械名くらいは言っても問題ないと思いますが。出したほうがもっと解決しやすい回答を得られると思いますよ。蛍光物質名も。書いてある波長が間違っているのかもしれないし。 ちゃんと測定できているのかどうかは蛍光物質だけを入れて測定すれば結果は得られるでしょう。蛍光物質だけ、蛍光標識抗体だけで比較すれば標識が上手く行っているかわかるでしょう。 どんな機械かしれないけど、検出限界以下のような気がします。

(無題) 削除/引用 No.861-8 - 2009/07/15 (水) 09:10:21 - DNAI 自作の蛍光標識抗体で希釈系列を作り、その蛍光値を測定してみてはいかがですか。溶液ベースですが、標識の成否は確認できると思います。

何度もすみません 削除/引用 No.861-7 - 2009/07/15 (水) 06:41:42 - やまもとや 蛍光と吸光度両方を兼用で測定する機器を、今年購入しました（私がではありませんが）が、「透過側からも蛍光を測定できる装置」かどうかは、わかりません（勉強不足ですみません）。 今やっている実験の質問なのですが 固相抗体→ブロッキング→抗原→蛍光標識抗体 の流れでサンドイッチELISAを行っているのですが、測定法としては問題ないとすれば、「抗原濃度依存的に蛍光強度の上昇が見られない」理由としては、やはり、蛍光標識抗体に問題がありますか？ というのは、標識キットを使用して、自分で抗体に蛍光ラベルしたので、そのあたりが不安です。 ラベルがうまくできているかどうかは、どうやってチェックすればいいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.861-6 - 2009/07/14 (火) 22:30:18 - CJ なお、ふつうＥＬＩＳＡって酵素抗体法を使ってＤＡＢの発色とかでシグナルを検出するのでしょうが、このような発色反応と比べて蛍光抗体のほうが理論上は抗原量とシグナルとの間の線型性が高い（シグナル飽和が起こりにくい）ので、蛍光法は定量性のより優れた方法であると思います。 私はＥＬＩＳＡはやったことがない素人なので、参考までに。

(無題) 削除/引用 No.861-5 - 2009/07/14 (火) 22:15:43 - AP ああ、入れ違いになってしまいましたね。

(無題) 削除/引用 No.861-4 - 2009/07/14 (火) 22:13:42 - AP プレートにとラップされた抗体についている蛍光物質に励起光をあてて放出される蛍光を測るわけですから、基質云々はCJさんのおっしゃるとおり必要ないですね。 >ちなみにプレートリーダーは上下方向から光が通過するタイプです。 というのがまた、怪しいような気がするんですが。蛍光測定するなら吸光度（特定波長の光の透過度）を測る普通のプレートリーダーではなくて、専用の蛍光プレートリーダーを使わなければなりませんよ。同じプレートリーダーでも、蛍光用はかなり高価な装置で、吸光度測定と兼用になっているとしたらこれまた結構なハイグレード品です。この点、OKですか？　蛍光リーダーの場合、上から励起光を当てると同時に、上側の検出器で測定するのが普通で、迷光を防ぐためにわざわざ光を透過しない黒色プレートを使うくらいなんですけれど。透過側からも蛍光を測定できる装置もあるようですが（ただしプレート越しになるので波長域が狭くなる）、そういうのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.861-3 - 2009/07/14 (火) 22:08:42 - やまもとや そのプレートリーダーには適切な励起光を発生する光源はありますか？ というご質問ですが、蛍光強度を測定するプレートリーダーで、励起光を発生する光源はあります。 ちなみに、励起波長650 nm　測定波長668nmです。

(無題) 削除/引用 No.861-2 - 2009/07/14 (火) 21:45:49 - CJ ＥＬＩＳＡはやったことないですが、 蛍光抗体は「蛍光」だから基質は必要ないですよ。 基質が必要なのは「発光」です。 そのプレートリーダーには適切な励起光を発生する光源はありますか？

ELISA（蛍光法） 削除/引用 No.861-1 - 2009/07/14 (火) 19:42:08 - やまもとや 固相抗体→ブロッキング→抗原→蛍光標識抗体 の流れでサンドイッチELISAを行っています。 最後の蛍光標識抗体を反応後、洗浄してプレートリーダーで測定することになっているのですが、基質がなく、溶液がない状態で蛍光強度をみることはできるのでしょうか？ （この方法には疑問を感じています） この方法では抗原濃度依存的に蛍光強度の上昇が見られません。 どこに問題があるか教えてください。 ちなみにプレートリーダーは上下方向から光が通過するタイプです。 よろしくお願いします。

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