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(無題) 削除/引用 No.860-9 - 2009/07/15 (水) 13:23:33 - あべちゃん 50uMのハイブリさせたオリゴDNAを1uL これはvector側のモル数に比べて遙かに多いんじゃないですか？ 僕の場合、オリゴをベクターに導入する際は、TOPOシステムを使いませんので、比率がわからないのですが、通常のライゲーションによりオリゴDNAを挿入する際は、200−500倍ほど希釈したハイブリオリゴDNAを使っています。 希釈液は水ではなくSTEなど生理的塩濃度の物を使ってます。 2分子のハイブリオリゴDNAが1分子のTOPOベクターの両末端にぺたぺたくっついてしまって、ほとんど目的の物がとれないとか。 あと、TOPOって挿入側のDNA末端のリン酸基要求性はどうなっているですかね？ TOPOキットは、PCR産物などを挿入することを前提としているはずなので、ハイブリオリゴDNAと違って燐酸化されてますが・・・

(無題) 削除/引用 No.860-8 - 2009/07/15 (水) 13:06:41 - 通りすがり >配列を確認してもインサートが入っていません この確認は何で行いましたか？ コロニーＰＣＲ？シークエンス？制限酵素処理＋電気泳動？

(無題) 削除/引用 No.860-7 - 2009/07/15 (水) 12:54:07 - 匿名 みなさん、作業過程の情報が少なくて申し訳ありません。 まず、70塩基のオリゴDNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖を受託で合成し、10 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaClの溶液に溶かし、100 pmol/lにしました。これを10μlずつ混合し、ブロックインキュベートで95℃、5分間処理し、その後スイッチを切り2時間室温までさめるまで放置しました。配列は間違いなく相補鎖になっています。 次にその反応液1μlを用いてエントリーベクターにクローニングしました。これはインビトロジェンのTOPOクローニングシステムを用いているので、ベクターを制限酵素処理あるいは脱リン酸化はしておらず、キットに添付されてるものをそのまま使用しています。またオリゴはリン酸化などの修飾は何もしていません。ライゲーションといってしまったのでみなさんに誤解を与えてしまい申し訳ありませんでした。以後気をつけます。 アニールした反応液とエントリーベクターの混合液を大腸菌にトランスフォーメンションすると、一応コロニーは生えてくるのですが、配列を確認してもインサートが入っていません。 自分としてはどこで間違っているのかがわからないので、 みなさんのお力をお借りできれば幸いです。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.860-6 - 2009/07/15 (水) 05:23:02 - あべちゃん >[Re:5] Pumpkinさんは書きました : > ものぐさせずに、ちゃんとやったことを最初から最後まで書きましょう。全然、つかめません。アニールしない可能性を考えられているのですが、相補配列は間違いないのですよね？最近40bp程度のものをクローニングしましたが、アニールしたオリゴのリン酸化物とベクターの脱リン酸化物のライゲーションで8つひろって8つあたりでした。もちろん、条件が違いますから参考になりませんが。 > 私もアニールしたオリゴのライゲーションはかなりの高確率で当たりを拾えるので、何か作業過程でトラブルを抱えているかも知れません。 実際に行った作業を書けば、トラブルシューティングがすんなりといくかも知れませんよ。 もちろん、遺伝子名とか配列は書く必要ないですが。

(無題) 削除/引用 No.860-5 - 2009/07/14 (火) 23:00:06 - Pumpkin うーん、エントリークローンの作り方はいくつかあるのですが...ライゲーションと言っているので、ベクターを制限酵素で消化して、アニールしたオリゴをライゲートしているということでしょうか。TOPOクローニングしているわけではなさそうですが。 オリゴDNAもしくはアニールしたオリゴをリン酸化していないということは、ベクターのセルフライゲーションが疑われるわけです。ベクターを２種類の制限酵素で消化している（もちろん消化面が同じ相補配列にならないこと）か脱燐酸化する必要があるわけですが、オリゴを燐酸化してないということはベクターは当然脱燐酸化されていないわけですね... ものぐさせずに、ちゃんとやったことを最初から最後まで書きましょう。全然、つかめません。アニールしない可能性を考えられているのですが、相補配列は間違いないのですよね？最近40bp程度のものをクローニングしましたが、アニールしたオリゴのリン酸化物とベクターの脱リン酸化物のライゲーションで8つひろって8つあたりでした。もちろん、条件が違いますから参考になりませんが。

(無題) 削除/引用 No.860-4 - 2009/07/14 (火) 21:12:41 - 匿名 情報が少なくて申し訳ありません。 アニールのときの溶液の組成は、10 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaClです。 オリゴDNAはリン酸化などの修飾は何も行っておらず、インビトロジェンの エントリーベクターに反応液をそのままあるいはカラムで精製後、 ライゲーションを行いました。

(無題) 削除/引用 No.860-3 - 2009/07/14 (火) 19:45:49 - とおりすがる ポリアクリルアミドゲルならば多くの場合は一本鎖と二本鎖は区別できます。

(無題) 削除/引用 No.860-2 - 2009/07/14 (火) 18:54:35 - Pumpkin もうちょっと詳しく書かれたほうがいいですね。 例えば、 アニールのときの溶液の組成 オリゴ末端の形状とベクターの形状 リニアなベクタに問題がないか オリゴをリン酸化しているのか リン酸化されたオリゴを使ってアニールしたのか ベクタを脱リン酸したのかしていないのか などなど。

オリゴDNAのアニールについて 削除/引用 No.860-1 - 2009/07/14 (火) 18:19:55 - 匿名 みなさんいつも勉強させてもらっています。 現在、70塩基のセンス鎖とアンチセンス鎖をアニールして 2本鎖DNAを作製し、ライゲーションを行っているのですが、 目的のインサートが得られません。 そこで本当に二本鎖DNAの形成がうまくいっているのかを確認したいのですが 泳動して1本鎖DNAと２本鎖DNAの区別がつくのでしょうか？ アニールの方法はオリゴDNAを等モルで混合し、ブッロクインキュベートで95℃で5分間処理し、その後スイッチを切り室温に冷めるまで放置しています。 どうぞよろしくお願いいたします。

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