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(無題) 削除/引用 No.860-29 - 2009/10/14 (水) 18:13:31 - Pumpkin いまさらですが、匿名さんはTOPOクローニングだったのですよね。ということは「リン酸化してはいけない」わけですね。また、5'側にはCACCという配列を付加する必要がありますがこれは問題なかったのでしょうか（最新のTOPOのdirectionalではそうなってますね）。 うまくいったことをお祈りしていますが。

うまくいきました 削除/引用 No.860-28 - 2009/10/08 (木) 16:11:59 - take オリゴをkinase処理後のフェノクロ、通常法のエタ沈でロスしてしまったのではと心配していたのですが、無事ベクターへのライゲーションがうまくいきました。ベクターには他のインサートがすでに入っていて約10kb、これの 75ngに、モル比1：100でオリゴとライゲーションして充分量のコロニーがでました。オリゴは両端別の制限酵素サイトの突出末端で53b、それぞれ100pmolを用いてアニーリング（90℃５min、1℃/minで温度を下げる）、kinase処理後、通常のフェノクロ、エタ沈をしました。モル比を出すときはオリゴ100pmolがそのまま残ったとして計算、ロスした分を考慮してさらにオリゴを多くしたのもやってみましたが、コロニー数が減りました。 多くのみなさんが投稿していただいて、とても勉強になりました。今後の参考にします。

(無題) 削除/引用 No.860-27 - 2009/10/07 (水) 16:55:32 - A 既に同じ意見がいくつも出ていますが参考までに。 32merのDNAオリゴをアニーリング、リン酸化後にフェノクロ、エタ沈して インサートに用いるというコンストラクトをこれまでに100近くつくった ことがあります。実は現在も20コンストラクトほど行っている最中です。 ライゲーションサイトはアニール後に異なる突出末端が両側にできるよう オリゴを設計しています。 1.センスとアンチセンスの100uM溶液(TE)、20uLづつを混合してPCRマシンで99度 で15分熱した後に2時間かけてゆっくりと室温まで冷却。 2.1uLのアニール後溶液をT4カイネースでリン酸化 3.フェノクロエタ沈(-80度で1時間)でDNAを回収（何もキャリアを使っていませんが大抵 沈殿が見えます） 4.150uLのDDWで溶かした後、5-100倍の範囲で希釈した溶液1uLを100ngの 脱リン酸化したリニアベクターとライゲーション という方法で行っています。同僚とも何度か議論したことがありますが 一番重要なのはインサートの量の様です。エタ沈後に回収できたDNA量が 定量できるといいのですが残念ながら量が少なすぎるようでいい方法が 見つかりませんでした。経験的にはインサートの量が少ない方が良い 結果が得られるようです。おそらくインサートが多すぎると2つの インサートがライゲーションサイトに入ろうとしてしまいうまく行かないの ではという推測で今のところ落ち着いています。何人もの方がおっしゃって いますが私のインサートの量から考えるとトピ主さんのインサートの量は 多いのでその辺りが一番のネックになっているのだと私も思います。 私はTOPOではなく通常のライゲーションで行っていますからTOPOが何らかの 悪さをしているかどうかについてはなんともいえません。

(無題) 削除/引用 No.860-26 - 2009/10/07 (水) 12:37:43 - 中年 Pumpkin様、 なるほど。横質問にお答えいただきましてありがとうございました。 皆様、 お騒がせしました。

(無題) 削除/引用 No.860-25 - 2009/10/07 (水) 12:05:00 - AP >オリゴをアニーリング後、リン酸化したものをフェノクロ処理+エタ沈してライゲーションをしようとしているのですが、40bpのような短いフラグメントはエタ沈で落ちないというのをフォーラムの中で見てあせっております。 落ちないわけじゃなく、落ちにくいかもしれないけれどちゃんと落ちるし（アダプターやプライマーのような短いフラグメントやモノヌクレオチドを除去する目的で普通のEtOH pptしてもほとんど効果ないですから）、回収の手段の一つとしては間違っていません。 ただ、短い核酸（おおよそ100 bp以下）や、非常に微量（例えばpg オーダー）の核酸をEtOH pptするのに効果的だといわれるtipsはいくつかあります。 ・遠心する前にフリーザーに入れて時間をおく（-80℃1時間とか、-20℃ O/Nとか）。 ・遠心時間を長くとる（通常10分のところ30分とか）。 ・通常の塩の他に、10 mM程度にMgCl2を加える。 ・キャリアを利用する。 これは短い核酸に限ったことではないですが、真空乾燥は禁忌です。特に短い二本鎖の場合は真空乾燥で（もちろん比較的穏和な加熱によっても）一本鎖に解離する可能性があります。 それと短い核酸は、フェノールクロロフォルム抽出する場合は、塩濃度をある程度高くしておかないと、有機溶媒層にいってしまってロスする可能性があるので注意です。

(無題) 削除/引用 No.860-24 - 2009/10/07 (水) 09:31:54 - Pumpkin 中年様 >突出末端と平滑末端を選ぶ理由 そういう質問がくるのかなって思ってました^^;。好みの問題ですかね。後は、中年様はそのような間違えはないと思いますが、Xho1とSal1で切るとか、そういう間違いもなくなるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.860-23 - 2009/10/06 (火) 14:50:26 - 中年 70bpあればキャリアを入れればきっちりEtOH沈殿されます。ただ、この場合はやはりモル比が問題なのだと思います。 蛇足ですが、オリゴは長くなるとたとえ精製にお金を掛けても出来が悪い印象があります。この場合だったら、私なら70ntのオリゴ２本の代わりに20bpオーバーラップするような45ntを２本合成して、鋳型無しでPCRをして二本鎖にします。 ＞Pumpkin様 横質問で申し訳ないのですが、突出末端と平滑末端を選ぶ理由をお教えいただけませんか。

(無題) 削除/引用 No.860-22 - 2009/10/06 (火) 12:42:13 - Pumpkin >オリゴをアニーリング後、リン酸化したものをフェノクロ処理+エタ沈してライゲーション take様 そもそも、アルコール沈澱する必要がありますか？クローニングですよね？ それと、例えばオリゴの5'末端にリン酸修飾をすることでオリゴのリン酸化工程を省けます。これは常用しています。 または、ベクター及びオリゴ末端を2種の制限酵素末端にしておけばセルフを防げますし、ディレクショナルになります。突出末端と平滑末端にしておくのが良いでしょう。これも常用しています。

(無題) 削除/引用 No.860-21 - 2009/10/06 (火) 09:34:56 - ザンギ 何かの事情で合成ＤＮＡをリン酸化する時は1本鎖の状態でやります。 ＰＮＫは２本鎖を基質にしにくいので。 エタチンしたければ後の工程に影響しないキャリヤを選んで加えれば。

(無題) 削除/引用 No.860-20 - 2009/10/06 (火) 09:09:26 - ばいや > オリゴをアニーリング後、リン酸化したものをフェノクロ処理+エタ沈してライゲーションをしようとしているのですが、40bpのような短いフラグメントはエタ沈で落ちないというのをフォーラムの中で見てあせっております。リン酸化の後はどのようにされていますか。 > そもそもリン酸化したことないです。いや、やったことあるんですが、効率が極めて低いです。よほど量を減らすなりしないと。そうするとエタ沈で落ちてくるかどうか。エタ沈にもいろいろな方法がありますが。 これまで私自身上手く行かなかったのはベクター調製のミス（切断酵素の種類の間違いや脱リン酸化してしまった）、そしてもっとも多いのがオリゴの設計ミス。まれに合成ミスも。

オリゴのリン酸化の後 削除/引用 No.860-19 - 2009/10/06 (火) 00:27:23 - take >[Re:10] Pumpkinさんは書きました : > 最近、私は約3.2kbのベクター20ngに40bpのインサート3ngをライゲーションしました。このインサートはオリゴを100mM Tris-Cl(pH7.4)-70mM MgCl2中で、70度で10分加熱して、25度まで1度/5minのレートで冷却してアニーリングしました。これをリン酸化して脱リン酸化したベクターとライゲーションしました。トピ主さんはTNEバッファですが、特に問題はないでしょう。 割り込んでオリゴの処理についてお尋ねします。 オリゴをアニーリング後、リン酸化したものをフェノクロ処理+エタ沈してライゲーションをしようとしているのですが、40bpのような短いフラグメントはエタ沈で落ちないというのをフォーラムの中で見てあせっております。リン酸化の後はどのようにされていますか。

(無題) 削除/引用 No.860-18 - 2009/08/11 (火) 09:06:38 - Pumpkin >vectorの濃度は残念ながら分かりません。 ザンギさんがおっしゃるように、インサート：ベクターモル比が重要な実験でありながら、ベクター濃度がわからないというのは問答無用だと思います。ちゃんと計測してから、比を計算するべきですね。

(無題) 削除/引用 No.860-17 - 2009/08/11 (火) 01:58:56 - ザンギ >[Re:16] 割り込み匿名係長さんは書きました : > これはinsertが多過ぎることが原因なのでしょうか？100uMのインサートを1ul使用です。vectorの濃度は残念ながら分かりません。このような実験のときはinsertは薄い方がよいのでしょうか？ ライゲーションで失敗しないコツは、目的産物以外はできないようにデザイン することです。 インサートをリン酸化して大量に突っ込んだら、それの多量体化がおこって しまうのは明らかです。 リン酸化したり、脱リン酸化したりする手間をかけてらっしゃるのに、 モル比を調整する手間を惜しまれるのか。

私も便乗して教えて下さい。 削除/引用 No.860-16 - 2009/08/11 (火) 00:57:57 - 割り込み匿名係長 私も同様の実験を行っているのですが、 私は平滑末端のligationです。insertにするoligoは40bpです。 段階的放冷（95℃10minから５℃刻みで5minおきに下げていきました）も行い insertをリン酸化させ、vectorは脱リン酸化させておりますが、 制限酵素cutすると、全く予想外の結果が得られます。（何か入っていると思われる結果になります） これはinsertが多過ぎることが原因なのでしょうか？100uMのインサートを1ul使用です。vectorの濃度は残念ながら分かりません。このような実験のときはinsertは薄い方がよいのでしょうか？ どうか教えてください。

(無題) 削除/引用 No.860-15 - 2009/07/16 (木) 09:58:17 - ザンギ 50bp程度の合成DNAなら何度かインサートしたことがあるので、その時の記憶を たどると．．． インサート量は対ベクターモル比で10倍から100倍程度だったような。 温度制御は自然放冷ではなくサーマルサイクラーで段階的に下げたような。 普通の合成DNAでベクターも含めて特にリン酸化等の修飾はしなかったような。 気がします。 その時は平滑末端の制限酵素の切断面に普通にライゲーションで挿入したは ずです。なので、そんなに効率の悪いものでもないと思うし、失敗した記憶 もありません。 モル比は何点かに振ってみればいいでしょう。 インサートが多すぎると、ベクターの両端に一個ずつインサートがついて しまわないでしょうか。 TOPOだと大丈夫なのかな？ 70bpの合成DNAだと少し長いので合成ミスの可能性はありませんか？ MSなんかで確認してるんでしょうか。 完全に対合する配列のDNAを2本でなくて、少しずらして4本以上の合成DNAを つなぐ方法もあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.860-14 - 2009/07/15 (水) 16:48:08 - あべちゃん >[Re:12] 匿名さんは書きました : > ちゃんとオリゴDNAが２本鎖になっているかの確認はポリアクリルアミドゲルなら可能なのでしょうか？ 1つ目の案 ハイブリ前の1本鎖オリゴを横のレーンに流せばいいんじゃないですか？ これも、2本鎖を作製した時と同じ過程を経れば、セルフで変なダイマーしているかどうかも判別付くでしょう。 １２％なら40bpくらい、２０％なら10bpくらいまで分離できるのだから、感覚的に言って、ハイブリできている物とそうでない物の分子量や分子の状態が大きく異なるのだから、泳動度の違いは出ると思いますよ。 ２つ目の案 それでも気になるようなら、S1 nuclease処理して、RNAのように変性電気泳動すればいいんじゃないでしょうか？ 元々1本鎖なら消化されるし、二本鎖なら耐性があるでしょう。しかし、酵素反応中に、剥がれそうな気もしますが、そこまでは、僕にはわからないです。

(無題) 削除/引用 No.860-13 - 2009/07/15 (水) 15:40:49 - とおりすがり denatureしてから室温に戻るまでの時間が早すぎてうまくアニールしていない可能性はないですかね？ 置き場所にもよりますが、ブロックインキュベーターのスイッチを切った後のブロックって意外とすぐ冷める気がします。 私の経験ですが、以前自作のアダプターを使用した際に ヒートブロックでdenature→スイッチoffでアニール→ライゲーション という手順で目的のものが全く取れなかったことがあります。 その後別の自作アダプターを作った時に、 温度設定を少しずつ下げて室温に戻す方法でもう少し丁寧にアニールしてみたら、あっさり成功しました（同じヒートブロック使用）。その後は同じ方法でいくつかのアダプターを使ってますが、失敗はないです。 それ以上詰めてないのでホントにそれが原因かと問いつめられると困りますが、一般的なプロトコルでは1時間以上かけてゆっくり云々と書いてあるものが多いので、可能性の1つとして考えて頂ければ．．．

(無題) 削除/引用 No.860-12 - 2009/07/15 (水) 15:24:42 - 匿名 みなさん、レスありがとうございます。 通りすがりさん、配列の確認はシークエンスで確認しました。 確かにあべちゃんさんがおっしゃるようにインサートの量が多いのかもしれません。 TOPOベクターはリン酸化されているので、オリゴDNAをリン酸化する必要はないと思うのですが・・・ 勉強不足で申し訳ありません。 ちゃんとオリゴDNAが２本鎖になっているかの確認はポリアクリルアミドゲルなら可能なのでしょうか？ みなさんよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.860-11 - 2009/07/15 (水) 14:35:26 - Pumpkin >約3.2kbのベクター20ngに40bpのインサート3ngをライゲーション すいません、インサート量は0.3ng-3ngの幅で何点かライゲーションしましたに訂正です。ただ、今回は結果にあまり差はありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.860-10 - 2009/07/15 (水) 14:32:49 - Pumpkin 最近、私は約3.2kbのベクター20ngに40bpのインサート3ngをライゲーションしました。このインサートはオリゴを100mM Tris-Cl(pH7.4)-70mM MgCl2中で、70度で10分加熱して、25度まで1度/5minのレートで冷却してアニーリングしました。これをリン酸化して脱リン酸化したベクターとライゲーションしました。トピ主さんはTNEバッファですが、特に問題はないでしょう。 TOPO側の問題のような気がしますが、マニュアルのFAQなどで思い当たる節はないでしょうか？

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