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mismatch PCR産物の制限酵素処理におけるトラブル トピック削除
No.850-TOPIC - 2009/07/12 (日) 14:20:16 - TＸ
mismatch primerをもちいてPCR-RFLPをおこない
ジェノタイプを決定しています。
その際、mismatch PCR産物の制限酵素処理において再現よく
切断できないでいます。


シークエンスprimerでポジコンおよびネガコンを
設定（doble cut, single cut、non-cut)しました。
NcoIは、PCRbuffer中では切断効率が悪るかったので
QIAGEN minelute PCR purification kitにて10mMTris-HCl(pH7.5)
にて溶出し、fermentasのtango buffer中で2U NcoI、4H処理しました。

条件設定では、うまくいっていたのですが
本実験では切断効率が悪かったりします。

mismatch primerのPCR産物の制限酵素処理はなかなかむずかしいのでしょうか。ご経験者がいらっしゃいましたら、ご教授下さい。

難しいなら、この産物をシークエンス解析に回そうかな
とも考えているのですが、200bpで読みたい場所が後ろから
20塩基ほどの場所にあります。解析可能でしょうか？
　
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dCAPS 削除/引用
No.850-7 - 2009/07/15 (水) 22:33:17 - ひよこ
要はdCAPSマーカーでマッピングをしたいといったところでしょうか？

昔よくやりましたが、PCR産物のうち1〜2ulを10ulの系で切って、問題になったことはないです。NcoIでやったことがあるかは覚えていないのでなんとも言えませんが。
そんなに潤沢ではないラボにいた頃なのでキット使うなんて選択肢はありませんでした。

>200bpと180bpを区別するのも結構しんどそうですね。
3%ぐらいのアガロースゲルで十分区別はついてルーチンで回してましたよ。

(無題) 削除/引用
No.850-6 - 2009/07/14 (火) 10:50:19 - あいうえお
200bpと180bpを区別するのも結構しんどそうですね。
切断効率が悪いと判断した根拠はなんですか？そのサンプルが
ヘテロである可能性は排除したんですよね？
PCRはゲノムをテンプレートにしているんですか？
血液からダイレクトにアンプリファイですか？これだと、切断効率わるくなるかもしれませんね。
本実験と条件設定の実験で違うところはどこですか？

RFLPよりはシークエンシングした方が結果の信頼性は向上すると
思います。100サンプルくらいまでなら、私なら躊躇なくシークエンスします。

(無題) 削除/引用
No.850-5 - 2009/07/12 (日) 23:30:36 - TＸ
> シークエンスprimerとmismatch primerの関係は？

シークエンスprimerはreverse primer。
mismatch primerはforward primerです。




> 「200bpで読みたい場所が後ろから20塩基ほどの場所にあります。」って、「PCR産物が200bpで、NcoI切断部位が、末端から20塩基ほどの場所にある＝PCR産物が200bpで、確認したいNcoI切断部位がプライマーがアニールする部位の近傍」ってこと？

そのとおりです。

mismatch primerとreverse primerで増幅したPCR産物が200bp。
調べたいSNPサイトがforward primerの3'末端の近傍にあります。

(無題) 削除/引用
No.850-4 - 2009/07/12 (日) 23:14:41 - TＸ
>[Re:2] 中年さんは書きました :
> よく分からないのですが、ミスマッチはプライマー部分にあるんですか？

整理しないまま書いて申し訳ないです。

プライマーの3'末端側にあります。
SNP部位に制限酵素サイトがないため、
ミスマッチプライマーによりSNP部位の近傍
に変異を導入してSNPサイトが制限酵素認識部位
になるようにしました。

？ 削除/引用
No.850-3 - 2009/07/12 (日) 22:46:14 - ats
質問が理解できないところ満載で、だれにも答えられないと思いますよ。
どうしてmismatch primerを使うのか、縮重プライマーのことですか？
条件設定って何？"doble cut, single cut、non-cut"って何（genotypingとの関係は）？とくに"double cut"って？PCR産物をNcoIが２カ所切断すること？
シークエンスprimerとmismatch primerの関係は？
「200bpで読みたい場所が後ろから20塩基ほどの場所にあります。」って、「PCR産物が200bpで、NcoI切断部位が、末端から20塩基ほどの場所にある＝PCR産物が200bpで、確認したいNcoI切断部位がプライマーがアニールする部位の近傍」ってこと？
これと「条件設定」との関係は？

(無題) 削除/引用
No.850-2 - 2009/07/12 (日) 22:11:45 - 中年
よく分からないのですが、ミスマッチはプライマー部分にあるんですか？

mismatch PCR産物の制限酵素処理におけるトラブル 削除/引用
No.850-1 - 2009/07/12 (日) 14:20:16 - TＸ
mismatch primerをもちいてPCR-RFLPをおこない
ジェノタイプを決定しています。
その際、mismatch PCR産物の制限酵素処理において再現よく
切断できないでいます。


シークエンスprimerでポジコンおよびネガコンを
設定（doble cut, single cut、non-cut)しました。
NcoIは、PCRbuffer中では切断効率が悪るかったので
QIAGEN minelute PCR purification kitにて10mMTris-HCl(pH7.5)
にて溶出し、fermentasのtango buffer中で2U NcoI、4H処理しました。

条件設定では、うまくいっていたのですが
本実験では切断効率が悪かったりします。

mismatch primerのPCR産物の制限酵素処理はなかなかむずかしいのでしょうか。ご経験者がいらっしゃいましたら、ご教授下さい。

難しいなら、この産物をシークエンス解析に回そうかな
とも考えているのですが、200bpで読みたい場所が後ろから
20塩基ほどの場所にあります。解析可能でしょうか？
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