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ネスティッド 削除/引用 No.846-9 - 2009/07/23 (木) 10:13:50 - めい ヒトゲノム計画でずっとシーケンシングをしていたのですが、その時に ベタイン、DMSOをいれても プライマーの位置をかえても 制限酵素で切っても ソニケーションしても トランスポゾンをつかっても 二次構造の片側だけを含むようにPCRをしてダイレクトシーケンシングしても 何をやってもどうしてもすさまじい反復配列や二次構造が崩れなくて読めないときの最終手段でMungbeanによるネスティッドをしました。 ここまでやっても読めないシーケンスは10kbのcaリピート以外なかったです。 ごさんこうまで

結果です。 削除/引用 No.846-8 - 2009/07/22 (水) 14:18:20 - yamasaki シーケンスの条件を変えてみましたが、だめでした。温度だけでなく、いろいろな部分を最適化しなくてはいけないのかも知れませんし、たまたま読めなかったshRNAの配列が強力すぎたのかもしれません。 Design and cloning strategies for constructing shRNA expression vectors Glen J McIntyre1,2 and Gregory C Fanning*1,3 の論文になかにあるXhoIで切るというやつですが、使っているベクターがSigmaのMissionのためうまい具合にループの配列がXhoI認識配列を含んでおりましたので試してみました。 結果として片方は読めたのですが、もう片方はshRNAまでは読めませんでした。理由は簡単でSigmaのp.LK0.1ベクターはXhoIサイトをもともと持っており、悪いことにはshRNAの挿入部近傍に１個ありますので、そこで切れてしまったためのようです。ループの配列を変えてp.LK0.1を切断しないか、切断してもshRNAのシーケンスに影響しないような制限酵素認識配列を持たせてやればこの方法はきわめて有用かもしれません。もっともそんなことしなくても読めるものなのかも知れませんが・・・。

(無題) 削除/引用 No.846-7 - 2009/07/16 (木) 06:38:51 - あべちゃん >[Re:4] APさんは書きました : > そういうこまった状況になったことはないんですが、プライマーを読めない配列近くまで、あるいはぎりぎり読めたところまで寄せてみたらどうでしょうか。 トピ主さん、すみません。 APさん、 読めない事がないというのは、何かポイントがあると思うのですが、もし差し支えなければ、ご教示願えませんでしょうか？ 例えばセンス鎖側に変異を入れるとして、何塩基分、変異を入れるとか、変異間の距離とか。 或いは、シーケンスを読む時のコツだとか。

(無題) 削除/引用 No.846-6 - 2009/07/16 (木) 00:58:29 - そば こういうトラブルシューティングは試すべき順番があるものなので、出来れば前のトピックを再利用して欲しかったですね・・・ で、サイクルシークエンス反応にDMSOを添加しても読めない場合は、 1)PCRで反応が進む条件を探す 上流と下流に設計されたプライマーを用いてPCRを行い、shRNA部分を含む領域で良好な増幅が確認できる条件を決定します。 2)その条件に合わせ、サイクルシークエンス反応の変更を行う ABIのBigDye terminatorの場合、メーカー推奨のプロトコールは96℃、50℃、60℃の反応ですが、上記のPCR条件に合わせてアニーリング温度、伸長反応温度を変更を行います。 （上記1で用いた酵素とサイクルシークエンスの酵素は反応液の条件が異なるため、上記1はあくまで”参考データ”として利用） 簡単に言ってしまえば、ヘアピン構造で止まってしまうprimer extention反応をより高温で行うようにすることでヘアピン構造を越えて反応が進むようにする、と言うだけの話。DMSO＋高温化というのも選択肢としては試す価値ありです（プライマーの変更も検討項目に含む）。 ただ、私もDMSO添加でも全く読めない配列というのは、あまり数多く経験していないため、参考になるかどうか・・・。 それでも、ヘアピン構造を組むような配列は変異の危険性が高いので、やはりシークエンスによる塩基配列確認を確実に行うべきだと思いますよ。

ありがとうございます 削除/引用 No.846-5 - 2009/07/12 (日) 09:05:07 - yamasaki みなさまレスありがとうございます。 確かに既出でしたね。キーワードを変えると出てきました。 Design and cloning strategies for constructing shRNA expression vectors Glen J McIntyre1,2 and Gregory C Fanning*1,3 の論文読んだんですが、すごく参考になりました。 ポイントミューテーションの話はオリゴ作成からやり直しですね。できたら今のままで行きたいところなので、入っていれば変異は多分ないとして進めるのけろろさんの意見に従います。 まあでも今後もレンチ使って行きたいので、いろいろ試しておこうかなあ。と思っています。

(無題) 削除/引用 No.846-4 - 2009/07/11 (土) 22:24:14 - AP そういうこまった状況になったことはないんですが、プライマーを読めない配列近くまで、あるいはぎりぎり読めたところまで寄せてみたらどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.846-3 - 2009/07/11 (土) 22:09:03 - ガイシュツ さんざん既出です。

(無題) 削除/引用 No.846-2 - 2009/07/11 (土) 20:00:31 - けろろ 私も同じような状況に直面しましたが、シークエンス読むのはあきらめて、直接ノックダウン効果を調べました。 （結果、シークエンス読めてないものが一番ノックダウン効果が高かったです。）

shRNA発現ベクターのシーケンス 削除/引用 No.846-1 - 2009/07/11 (土) 15:00:07 - yamasaki いつも勉強させてもらっています。現在shRNA発現ベクターを作成しております。レンチウイルスで発現する予定です。ベクターを制限酵素で処理し、ゲルから切り出しして、shRNA用にデザインしたオリゴ２本をアニールさせたものをライゲーションしてトランスフォーメーションし、コロニーダイレクトPCRでスクリーニングした後、当たりっぽいものについてシーケンスして確認しております。目的の遺伝子に対し５個作成予定で、２種の遺伝子で合計１０個のプラスミドを取ることになります。 この作業で半分以上のプラスミドはシーケンスまで完了し、目的のものが得られました。しかしどうしても残りのものがシーケンスできません。シーケンスできないといってもまったくできないわけではなく、shRNAの部分で急激に減衰して以降が読めなくなっているのです。おそらくshRNAが高次構造をとるためにそこをポリメラーゼが乗り越えられないのではないかと思っています。シーケンス用の調整としてはtempliphyで増幅したサンプルと、プラスミドをミニプレしたサンプルの両方を試しましたが、どちらでも読めませんでした。 一応ウエブで検索しましたところ、同じような現象に悩む研究者はいるようで、DMSOを入れる、変性温度を上げるなどのサジェスチョンがありました。それにしたがって検討しましたが、DMSO５％でも１０％でもだめでした。 どのようなにしたら良いものでしょうか？恐らく配列によっては何をやっても読めないものもあるのでは？と考える今日この頃なのですが、もし良い方法があるようでしたらご教授お願いいたします。

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