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gateway pENTRベクターへの導入が出来ず。。。 トピック削除
No.830-TOPIC - 2009/07/09 (木) 12:37:52 - ag
ArabidopsisでのGFP融合タンパク発現をやろうとしています。
gatewayシステムのディスティネーションベクターを用いるためエントリークローンを作成しています。

ちなみにインサートは2.4kbで、ATGから終始コドンの前までの翻訳領域全域です。


最初はCACC付加により挿入方向を決められる、pENTR/D-TOPOベクターを用いて行ったのですが、何度も条件を変えてやっても全く当たりコロニーが出てきません。出てくるコロニー数自体、インサートなしでクローニング反応を行ったネガコンと同程度です。

そこでベクターとの相性が悪いのかと考え、TAクローニングタイプのpCR8/GW/TOPOを使用してみました。


するとやや生育の悪めのコロニーでインサートが確認できましたが、インサートは逆向きに挿入されていました。
生育の悪いコロニーに絞ってプラスミドを取ってみたところ、１８株中１３株にインサートを確認、すべて逆向きでした。

理論上は正向き・逆向きは半々のハズですよね？
どうなってるのだろうと途方にくれています。
アドバイスお願いします。


解決策としてはベクターをまた変えるしかないかと思っていますが、他に方法あるでしょうか。

うちのラボではgatewayシステム以外でのGFP融合タンパク発現はやっていませんので、gatewayを使わないGFPベクターで良いものがあれば教えて頂けると幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.830-7 - 2009/07/09 (木) 17:26:19 - ザンギ
>30℃培養

忘れてましたが、僕はデフォルトでこの温度でした。
収量を増やす必要がない時は、培養時間が長くなりますが失敗は少ないです。

(無題) 削除/引用
No.830-6 - 2009/07/09 (木) 16:12:42 - 中年
> ただ割合は極端に低そうな気もします

ケースバイケースですが、運が良ければ30℃培養で問題が完全に解決することもありますよ。これで解決した経験がこれまでに３つのcDNAであります。

素早い回答ありがとうございます 削除/引用
No.830-5 - 2009/07/09 (木) 15:54:25 - ag
> 状況はインサートが大腸菌にとってtoxicであることを指し示しています。
>
> 形質転換後、プレートも含めて全ての培養を30℃で行うことでプラスミドのコピー数を下げ、toxicityを緩和することができます。もちろん、単位容量当たりのプラスミドの収率は下がります。


やはりそういうことだろうと思います。

育ちやすさが
正向き（アタリ）＜＜＜逆向き＜＜＜ハズレ　　であるなら、
低温培養すればアタリもでてくるかも？ですね。
ただ割合は極端に低そうな気もします



> pENTR1Aを使って切った貼ったでエントリー作られても堅実かと思いますが試されたでしょうか。

試してないです。最終手段ですね。
該当ベクターがラボにないので、注文してまでやるかというと微妙なんです。
結局インサートがtoxicなのであれば、できるかどうかもわからないですよね・・・



> 大腸菌の株によって好き嫌いに違いがあることもあるので、別の株で
> 試してみる価値はあると思います。

別の株ですか。D-TOPOの時には一度試したんですが、TAのベクターでもやってみたいと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.830-4 - 2009/07/09 (木) 13:47:47 - 中年
＞やや生育の悪めのコロニーでインサートが確認
＞１８株中１３株にインサートを確認、すべて逆向き

状況はインサートが大腸菌にとってtoxicであることを指し示しています。

形質転換後、プレートも含めて全ての培養を30℃で行うことでプラスミドのコピー数を下げ、toxicityを緩和することができます。もちろん、単位容量当たりのプラスミドの収率は下がります。

(無題) 削除/引用
No.830-3 - 2009/07/09 (木) 13:47:34 - ar
pENTR1Aを使って切った貼ったでエントリー作られても堅実かと思いますが試されたでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.830-2 - 2009/07/09 (木) 13:47:08 - ザンギ
GATEWAYに限らず、プラスミドの挿入配列によっては大腸菌が嫌がる
ことがあります。
大腸菌の株によって好き嫌いに違いがあることもあるので、別の株で
試してみる価値はあると思います。

gateway pENTRベクターへの導入が出来ず。。。 削除/引用
No.830-1 - 2009/07/09 (木) 12:37:52 - ag
ArabidopsisでのGFP融合タンパク発現をやろうとしています。
gatewayシステムのディスティネーションベクターを用いるためエントリークローンを作成しています。

ちなみにインサートは2.4kbで、ATGから終始コドンの前までの翻訳領域全域です。


最初はCACC付加により挿入方向を決められる、pENTR/D-TOPOベクターを用いて行ったのですが、何度も条件を変えてやっても全く当たりコロニーが出てきません。出てくるコロニー数自体、インサートなしでクローニング反応を行ったネガコンと同程度です。

そこでベクターとの相性が悪いのかと考え、TAクローニングタイプのpCR8/GW/TOPOを使用してみました。


するとやや生育の悪めのコロニーでインサートが確認できましたが、インサートは逆向きに挿入されていました。
生育の悪いコロニーに絞ってプラスミドを取ってみたところ、１８株中１３株にインサートを確認、すべて逆向きでした。

理論上は正向き・逆向きは半々のハズですよね？
どうなってるのだろうと途方にくれています。
アドバイスお願いします。


解決策としてはベクターをまた変えるしかないかと思っていますが、他に方法あるでしょうか。

うちのラボではgatewayシステム以外でのGFP融合タンパク発現はやっていませんので、gatewayを使わないGFPベクターで良いものがあれば教えて頂けると幸いです。
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