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yacopiさんへ 削除/引用 No.824-8 - 2009/09/16 (水) 18:01:01 - あべちゃん yacopiさん、 直接、メールを頂きましてありがとうございます。 こちらの掲示板でご質問に対する私なりの方法を説明させていただきます。 質問内容 ４ｘPEG-itに関して調製法を教えていただけないでしょうか？ 普通どれくらいのボリュームで何分遠心してウイルスを落としているのでしょうか？ まずこの方法は、下水から病原性ウイルスを濃縮するという実利的な研究論文を参考にして、私なりに応用してます。ref. Ann. Phytopath. Soc. Japan 40: 265-267 (1974) 調製方法 １．５０％のPEG6,000を320mL作ります。 ２．そこに、40mLの5M NaClを加えます。 ３．20 mLの1M HEPESを加えます。 ４．pHをNaOHで7.4に調整し、体積を500mLに合わせます。 ５．オートクレーブします。 ポイントは、高濃度グリセロールに対して、塩とHEPESを撹拌しながら徐々に加えるというところです。順序が異なると、溶解しない沈殿物が発生します。 ウイルスの濃縮方法 １．パッケージング細胞を15cm dish 2枚に播きます。 ２．サブコンフになったらトランスフェクション ３．48時間後に27mL分の培養上清をシリンジに移し、pore size 0.45のPVDFシリンジフィルターに通し、50mLチューブに移します。 ４．9mLの4x PEG solutionを、先ほどのウイルス上清に加えます。 ５．2,600xg、30min遠心します。 ６．上清を捨て、再度、2,600xg, 5min遠心します。 ７．残液を丁寧に除去します。 ８．OPTI-MEMを好みの量加えます。（私は、100x stockにするので、270uL加えます） ９．丁寧にピペッティングして、小分注したのち、-80度保存します。 １０．感染させたい時に、溶解させ、1x から 9x 程度のウイルス濃度になるよう、標的細胞に加えます。この時、polybreneを8-10ug/mL程度加えます。この時の培地は、私はOPTI-MEMですが、通常培地でも大丈夫です。 １１．4−8時間後に、PBS洗浄後、通常培地に戻します。 レンチでもレトロでも可能です。 以上です。

(無題) 削除/引用 No.824-7 - 2009/07/09 (木) 20:22:27 - ifn 皆さま 情報を教えていただき、助かりました。 出来ることから試してみようと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.824-6 - 2009/07/08 (水) 09:49:44 - T PEG沈は？ 市販されている商品もありますが、普通に自作できます。 限外濾過で濃縮する事もできますね。 詳しくは以下 http://www.currentprotocols.com/protocol/mb0912

(無題) 削除/引用 No.824-5 - 2009/07/08 (水) 09:46:58 - あべちゃん 精製というのは濃縮のことですか？ でしたら低速遠心ができるPEG-itが、ここの掲示板で以前紹介されていましたね。 ただ、PEG-itは高いです。なので、私は自作しております。 PEG-itは５ｘなのですが、自作するとどうしても５ｘにすると、PEGと塩との組み合わせのせいなのか、十分には溶解しません。 なので、自作の場合、やむを得ず４ｘにしております。 PEG-itのようにポリエチレングリコールを使う方法だと、2,600x g位で十分にウイルスを沈殿できます。

(無題) 削除/引用 No.824-4 - 2009/07/08 (水) 09:40:47 - ifn ＞　No.824-2 - 2009/07/08 (水) 08:46:06 - NEKOさま ありがとうございます。 ご指摘の通り、virus液とvectorを混同させていました。 超遠心機を使用しないvirus濃縮についての質問でした。 ＞　No.824-3 - 2009/07/08 (水) 09:27:54 - ともさま ありがとうございます。 早速、試してみようとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.824-3 - 2009/07/08 (水) 09:27:54 - とも 超遠心機じゃなくても濃縮は可能です。 1.5mlのチューブでやりたいなら、1.5mlチューブに1mlくらいのウイルス液を入れて、6000xgで16hで4℃で遠心して、上清を捨てて、100μlに溶かせばOKですよ。それを10本やれば10mlくらいを1mlくらいに濃縮可能です。ウイルスを溶かす時によくピペッティングしてください。針を使ってもいいのですが、危ないのであまりお勧めはしません。

(無題) 削除/引用 No.824-2 - 2009/07/08 (水) 08:46:06 - NEKO ＞また、レトロウイルスベクターの精製を普通のマイクロ遠心器を用いて、＞エッペンで出来るという情報を聞きました。 ＞しかしながら、詳しい条件が分かりません。 retrovirusのvector(plasmid DNA)の精製なら、QIAGENなどのMiniprep kitなどで出来ます。普通のマイクロ遠心器でOKです。 ＞レトロウイルスをマイクロ遠心器で精製するときのプロトコールをご存知＞の方がおりましたら、教えていただけると幸甚に存じます。 本文全体を読んで感じたのですが、一体、virus液とvectorのどちらを精製したいのでしょうか？それとも、virusを濃縮したいのですか？ ＞レトロネクチンを用いて、精製しないウイルス液を使用することも考えています。 virusが培養液上清に出てくるのであれば、コンタミしてそうな細胞をマイクロ遠心器で軽く遠心して除去し、上清を使えばいいのではないでしょうか？ そうでなければ、virus作製に使用した細胞を培地とともに回収して、ドライアイスメタノールで細胞を破壊し、その後、マイクロ遠心器で上清を回収します。 virusを濃縮しないのであれば、超遠心機は不要だと思います。

レトロウイルスベクターの精製について 削除/引用 No.824-1 - 2009/07/07 (火) 14:06:34 - ifn レトロウイルスベクターの精製について、お聞きしたいことがあります。 現在の研究室のP2の部屋に超遠心がありません。 また、市販されている精製キットは高価で手が届きません。 レトロネクチンを用いて、精製しないウイルス液を使用することも考えています。 また、レトロウイルスベクターの精製を普通のマイクロ遠心器を用いて、エッペンで出来るという情報を聞きました。 しかしながら、詳しい条件が分かりません。 レトロウイルスをマイクロ遠心器で精製するときのプロトコールをご存知の方がおりましたら、教えていただけると幸甚に存じます。 よろしくお願いいたします。

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