BioTechnicalフォーラム [pGL4でのクローニング]

SNPsかきれのこり

No.823-19 - 2009/07/10 (金) 13:11:09 - めい

>>[Re:10] DDDさんは書きました :
>> ３．digestion後のPCRプロダクトを再度ゲルから精製する。
>> このときのプロダクトのサイズは5kbに見えるんでしょうか？

>話がややこしくなり，すみません。
>先にお話ししましたように，このときbandが5kbと3.5kb，1.5kbの3本のbandになるのです。

PCR産物が消化後３本になるということは

１：本当は内部にHindIIIかEcoRVがあるのだがDNAが多すぎて切れ残っている。

２：鋳型はゲノムからなのでSNPsがあり、片方のアレルが切断部位を持っている。
　　ーー＞　ので、小さい方ばかり取れる。

(無題)

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No.823-17 - 2009/07/10 (金) 10:10:17 - removed

僕を含めラボ内で何人か似たような経験があります。
制限酵素処理したサンプルをチェックのために電気泳動した時は予想通りの大きさなのに、
カラム（キアゲンだったかな？）で精製すると２，３本になってました。
原因はわからないままですが、素直にやり直すと上手くいきました。
何を変えたわけでもないんですが・・・
精製法を替えるのも手かもしれませんね。
制限酵素処理してそのままフェノクロ・エタ沈してライゲーションに持ち込むとか。

(無題)

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No.823-16 - 2009/07/10 (金) 09:11:48 - 通りすがり

あまり参考にならないかもしれませんが...
一応、同様の症状を経験しました。

他のベクターに比べてpGL4はうまく行きにくかったです。
（Bluescriptには簡単に入ったのにpGL4では目的のものが取れない、等）

あれこれやって、最終的にはうまく行きましたが、
結果に影響したと思えることは
確実に切れる制限酵素を選んだ、
切り出し時のUV照射を「ゼロ」にした、くらいでしょうか。

pGL4.10は切り出しなし（制限酵素処理、CIAP処理後、カラム精製）。
insertはTOPO-XLというキットを参考にUV照射を行わず切り出しをして
7kbのinsertを入れました。
それでも確率は1/10-20位だったと思います。

(無題)

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No.823-15 - 2009/07/09 (木) 00:55:56 - DDD

PRIME STARでPCRをかけた産物の大きさは？(5kb)
それをHind III，Eco RVで切った後、そのままゲルに流すとバンドの大きさは？(5kb?のままor3.5kb+1.5kb?or3.5kb+1.5kb+5kb?)

pGL4をHind IIIのみでcutしたら4.1kb?
pGL4をEco RVのみでcutしたら4.1kb?
pGL4をHind III，Eco RVでcutしても4.1kb?

PCR productが酵素処理前後のどちらも5kbのバンドしか出なければ
とりあえず問題なし。

vectorについてもどれも4.1kbにでるなら問題なし。

確認してみてください。

(無題)

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No.823-14 - 2009/07/08 (水) 12:52:45 - ~

#5に出てきた大学院生は、流しただけで結果を見ても何も提案はしなかったのでしょうか？
後輩のトラブルに対して中途半端な手伝いの仕方に見えますが。

ベクターのバンドすら見えていないのでしたら、シークエンシングはやめた方がいいと思います
シークエンシング用のプライマーが結合する部分があるのかすら分からない状態でしょう。

今取れているベクターの簡単なチェックと、PCRからのやり直しをお勧めします。
(念のため、ベクターも切りなおしましょう)

>ライゲーション後にインサートの確認をしたら，3.5kbp辺りに1本だけbandが出たという経緯です。

この操作を行うときには、制限酵素を添加しない環状ベクターも一緒に流していますか？
no cut, HindIIIのみ, EcoRVのみ，両方添加でチェックすると、制限酵素サイトが生きているのかも分かります。

PCR後に、ダイレクトに目的のベクターに入れるのは確かに効率がいいですが、
1回問題が生じたのであれば、次回はTベクターなどにも入れておいたほうがいいと思います。
5kbだとちょっと入れにくいと思いますが、毎回PCRをする手間や、HindIII、EcoRVサイトがインサート中に無いかの確認などを考えると効率がよくなると思います。

(無題)

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No.823-13 - 2009/07/08 (水) 10:02:49 - Pumpkin

うさんと同意見で、

1.再度PCR産物を消化して、5kbのみのバンドが得られることを確認する。

2.pGL4を消化して、4.1kbのみのバンドが得られることを確認する。

の2点ですね。やっぱり1も2も怪しいですよ。5kbの内部で実は消化されて（これはHind3とEcoRVの認識配列がある他に、制限酵素自体が汚染されている可能性も含む）、3.5と1.5kbが出ている。5kbのfragmentは未消化産物で、トピ主さんはこれをクローニングしたため、インサートチェックの段階で消化されて3.5kbが出てくると。

という仮定をすると、実はここで5+4.1+3.5+1.5kbの4本が見えなくてはいけないんですね。そもそも、うさんがご指摘されていますがベクターの4.1kbが見えないのは決定的にまずいですね（ちゃんと分離できるアガロース濃度ですよね）。

やっぱり、うだうだ悩んでいないで再コンストラクトした方が早いですね。2日あれば結果でますしね。

(無題)

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No.823-12 - 2009/07/08 (水) 08:14:11 - う

結局、

・PCR産物を制限酵素処理すると、３本のバンドが確認されるのか？（精製処理せずに）

・ベクターのみ（ライゲーションに使用する）を制限酵素処理した後電気泳動すると（精製処理せずに）ちゃんと4,1kbpのバンドが単一で確認されるのか？

それらをやってみないと何が起こっているのかわかりません。

＞ベクターはpGL4の一番基本のもので4.1kbpです。それに，5kbpのプロモーター領域をクローニングすべくトライし，ライゲーション後にインサートの確認をしたら，3.5kbp辺りに1本だけbandが出たという経緯です。

このことはライゲーションがうまくいっているとか、いないとかの問題では無いと思います。
だって、インサートが存在しなくても、4.1kbpのベクターのバンドは確認されるはずでしょ？

上の２つのことをやってみないとわかりませんが、私は制限酵素がまず怪しいと思います。
もしくは、ベクターとかインサートの制限酵素マップが変か。

ややこしくてすみません

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No.823-11 - 2009/07/07 (火) 22:51:13 - ligation太郎

>[Re:10] DDDさんは書きました :
> ３．digestion後のPCRプロダクトを再度ゲルから精製する。
>
> このときのプロダクトのサイズは5kbに見えるんでしょうか？

話がややこしくなり，すみません。
先にお話ししましたように，このときbandが5kbと3.5kb，1.5kbの3本のbandになるのです。

ありがとうございます

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No.823-9 - 2009/07/07 (火) 20:54:38 - ligation太郎

ありがとうございます。
> MCS内のEco RV，Hind IIIで切り出したのですよね？切り出される断片なんて数十bpでしょう？1本しか見えなくて当たり前ではないのですか。
うさんへのお答えにもなりますが，ベクターはpGL4の一番基本のもので4.1kbpです。それに，5kbpのプロモーター領域をクローニングすべくトライし，ライゲーション後にインサートの確認をしたら，3.5kbp辺りに1本だけbandが出たという経緯です。

> うーん、良く分からないけど、2本の予定外のサイズを足すと目的のサイズになるところが怪しいです。インサート内部で本当にEco RV，Hind IIIで消化されませんか？(2)と(3)の間でそんな風に切れることはないですよ。DNaseのコンタミみたくスメアーになるとかならまだしもバンドとして綺麗にでてくるとは。（トピ主さんも「なんと」と言っていますが、怪しいとおもっているんですよね？）
一応クローニング前に5kbpの領域をNEB cutterで確認をし，制限酵素サイトのないEco RVとHind IIIを選んでいます。ですので，そのような間違いはないと思っているのですが・・・。

(無題)

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No.823-8 - 2009/07/07 (火) 18:52:00 - Pumpkin

うさんが、おっしゃる通りベクターサイズが分からないのであれですが(pGL4はいくつもの種類があり、さらにあれですが）、

> といっているので大丈夫なんでしょうが、一応確認すると、ベクターもPCRプロダクトと同じようにEco RV，Hind IIIで切り出して精製しているのですね。

>仰る通り，Eco RV，Hind IIIで切り出して精製しています。出てきたサイズはおおよそ3.5kbp位の長さです。その際，おかしいのはインサートとベクターで2本出てくるのでは？と思ったのですが，バンドはどうしても1本です。

MCS内のEco RV，Hind IIIで切り出したのですよね？切り出される断片なんて数十bpでしょう？1本しか見えなくて当たり前ではないのですか。

>あとの２本は1.5kbpと3.5kbp位で，２本の和がちょうどPCRプロダクトのサイズに相当する

うーん、良く分からないけど、2本の予定外のサイズを足すと目的のサイズになるところが怪しいです。インサート内部で本当にEco RV，Hind IIIで消化されませんか？(2)と(3)の間でそんな風に切れることはないですよ。DNaseのコンタミみたくスメアーになるとかならまだしもバンドとして綺麗にでてくるとは。（トピ主さんも「なんと」と言っていますが、怪しいとおもっているんですよね？）

もうう一度一から慎重にコンストラクトするか、~さんがおっしゃるようにインサートの中身を見るしかないと思います。頂いた文面からは、解決につながるアドバイスをできそうにありません。

順序が逆になりましたが

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No.823-6 - 2009/07/07 (火) 17:52:48 - ligation太郎

みなさまありがとうございます。順序が逆になりましたが・・・。

> 予想と違う小さいバンドとは、目的のものと比べてどのくらい小さいのでしょうか？

目的サイズは約5kbpで予想と違うものは約3.5kbpです。

> PCR productのdigest後もゲル精製されているということなので、切れ端が入ることはないとすると、なんですかね。消化がうまくいってなければ入りませんが、逆に言えば入るようなものもできないはずですね。ネガコンが生えないのはいいとして、目的のライゲーション産物でどのくらいのコロニーが得られたんでしょうか。

今回コロニーはプレートに蒔いた量が多めというのもありますが，かなりたくさんのコロニーが生えました。ちなみにネガコン（インサートを入れないもの）はコロニーは数個といった状態でした。

> プロモーターが高次構造をとってデリーションしてしまうような気がします。
> ウイルスベクター用のコンピテントセルがラボにあったら、試してみると改善するかもしれません。

残念ながら，ウイルスベクター用のコンピテントセルは今のところ手元にありません。

引き続きお願いいたします。

みなさまありがとうございます

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No.823-5 - 2009/07/07 (火) 17:44:38 - ligation太郎

> といっているので大丈夫なんでしょうが、一応確認すると、ベクターもPCRプロダクトと同じようにEco RV，Hind IIIで切り出して精製しているのですね。

仰る通り，Eco RV，Hind IIIで切り出して精製しています。出てきたサイズはおおよそ3.5kbp位の長さです。その際，おかしいのはインサートとベクターで2本出てくるのでは？と思ったのですが，バンドはどうしても1本です。

その後，（１）最初のPCRプロダクト，（２）キアゲンの精製キット（ゲルから切り出し精製するもの）で精製しプロダクトの両端を制限酵素処理したもの，（３）（２）を再度キアゲンの精製キットで精製したものを流した（確認のため大学院生が流してくれました）ところ，なんと（１），（２）はPCRプロダクトのサイズ（5kbp）のバンド1本だったのですが，（３）はバンドが3本になっていました。うち１本は（１），（２）と同じサイズで，あとの２本は1.5kbpと3.5kbp位で，２本の和がちょうどPCRプロダクトのサイズに相当する感じで，かつ3.5kbpのバンドが最初に書きました「異なるサイズのバンド」の長さに相当するのです。
キアゲンのサポートに聞いてみたのですが，可能性としては，切り出しの際にUVに当てすぎている可能性，そして最初のゲル溶解のバッファーQGで長時間incubateするとそのようなことがあり得るとの返事でした。今まで同じキットを何度も使っているのですが，このようなことはありませんでした。
みなさまはこのような御経験はお持ちでしょうか？また，どのようなことが考えられるのでしょうか。御意見賜りたく存じます。よろしくお願いいたします。

(無題)

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No.823-3 - 2009/07/07 (火) 15:44:00 - Pumpkin

>ネガコンのプレートではほとんどコロニーが生えなかった

といっているので大丈夫なんでしょうが、一応確認すると、ベクターもPCRプロダクトと同じようにEco RV，Hind IIIで切り出して精製しているのですね。

>全てのコロニーで予想とは異なるサイズ（短いサイズ）のバンドが認められます

次に、これはEco RV，Hind IIIで切り出しているんですよね？MSC内にある他の制限酵素で切っていてインサート内で切れてるなんていうことは。。。ないか。

PCR productのdigest後もゲル精製されているということなので、切れ端が入ることはないとすると、なんですかね。消化がうまくいってなければ入りませんが、逆に言えば入るようなものもできないはずですね。ネガコンが生えないのはいいとして、目的のライゲーション産物でどのくらいのコロニーが得られたんでしょうか。

(無題)

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No.823-2 - 2009/07/07 (火) 14:29:51 - ~

まずは中身を読むか、制限酵素地図を作って、
目的のものの一部が入っているのか、無関係なものが入っているのかを調べてみてはいかがでしょうか。

プロモーターが高次構造をとってデリーションしてしまうような気がします。
ウイルスベクター用のコンピテントセルがラボにあったら、試してみると改善するかもしれません。

pGL4でのクローニング

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No.823-1 - 2009/07/07 (火) 13:38:42 - ligation太郎

みなさま，いつも勉強になりありがとうございます。
少し御相談したく，投稿しました。

とあるプロモーター領域（約5kbp）をpGL4にクローニングしようとしていますが，なかなかうまくいきません。
１．forward，reverseのプライマーそれぞれにEco RV，Hind IIIのサイトを付けて白血球から抽出したゲノムをテンプレートにタカラのPRIME STARでPCRをかける。
２．PCRプロダクト（正しいサイズのバンド１本が出る）をゲルから切り出し，Hind III，Eco RVの順にdigestionをする。
３．digestion後のPCRプロダクトを再度ゲルから精製する。
４．1:3，1:5の比でpGL4を使いライゲーションを行う（タカラの一番一般的なライゲーションキットを使用）。
５．DH5αで形質転換
の順に行っています。PCRプロダクトのサイズは正しいのですが，形質転換後のコロニーをpick upしカルチャー後miniprepで抽出し制限酵素で切り出して確認をしたところ，全てのコロニーで予想とは異なるサイズ（短いサイズ）のバンドが認められます（それらのサイズは各コロニーで同一）。ネガコンのプレートではほとんどコロニーが生えなかったのでこれはいけたのでは？と思ったのですが，何回か行ってもどうしてもうまくいきません。
以前に，別の酵素（Taqポリメラーゼ）を用い，同じゲノムをテンプレートとして別のプロモーターをクローニングした時には全く問題がなかった（その時はKpn IとHind III）のですが，これはEco RVやPRIME STARに起因する何か理由があるのでしょうか？それとも別に原因があるのでしょうか？
アドバイス頂ければ幸いです。