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(無題) 削除/引用 No.818-21 - 2009/07/19 (日) 16:19:44 - qq >今自分の扱っているタンパク質がHisカラムから溶出後、透析でイミダゾール >を除去する過程で凝集してしまうため、そのようなことが本当にあるのか伺 >いたかったので 論文は知りませんが、経験はあります。 イミダゾールがないことが問題なのか、一緒に除去されたNiが問題なのか、と考えていますが、解りません。

(無題) 削除/引用 No.818-20 - 2009/07/19 (日) 12:48:42 - aimar おお様 ありがとうございます。 今自分の扱っているタンパク質がHisカラムから溶出後、透析でイミダゾールを除去する過程で凝集してしまうため、そのようなことが本当にあるのか伺いたかったのです。 今回はあぐるということではなく活性に影響をあたえるということだったのですね。 またお時間がある時に教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.818-19 - 2009/07/16 (木) 13:30:15 - おお >[Re:18] aimarさんは書きました : > 解決済みの話題で申し訳ないのですが、 解決済みということは私の気持ちの中ではありませんので、、、、 どなたかなにか気がついたらコメントが欲しいというかんじです. > > おお様のおっしゃっていた > ＞ある論文ではHISカラムでイミダゾールで溶出して、 > イミダゾールを抜かないで安定化しているという文献がありました。 > > についてうかがいたいことがあります。 > 　 > イミダゾールが透析によって溶液中から取り除かれるとタンパク質が凝集してしまう、ということが起こりえるということですよね？ これは実は活性という意味で安定ということです。 沈殿ということは言及していませんでした(多分、、、、)。 ただバッファーに溶けていても、あぐっているというのもありますし、 関係あるかもなあと漠然とおもったのですが、、、、 確かヘリケースだったと思います。 また後で文献引っ張り出してみます、、、今ちょっと時間がないので、、、

(無題) 削除/引用 No.818-18 - 2009/07/16 (木) 10:43:23 - aimar 解決済みの話題で申し訳ないのですが、 おお様のおっしゃっていた ＞ある論文ではHISカラムでイミダゾールで溶出して、 イミダゾールを抜かないで安定化しているという文献がありました。 についてうかがいたいことがあります。 　 イミダゾールが透析によって溶液中から取り除かれるとタンパク質が凝集してしまう、ということが起こりえるということですよね？ よろしければその文献を教えていただけませんか。

(無題) 削除/引用 No.818-17 - 2009/07/10 (金) 10:04:27 - おお >[Re:16] あべちゃんさんは書きました : > running bufferに亜硫酸ナトリウムを入れていれば、再酸化を防げるそうです。 > あと、pHもニュートラルなので、流れている間、蛋白質のおかれている状況はかなり違うでしょうね。 ありがとうございました。たしかに状況が違うという ところで期待するところもあります。 かえって移動ども変わって分からなくなったりするか もしれませんが、、、、

(無題) 削除/引用 No.818-16 - 2009/07/08 (水) 23:08:51 - あべちゃん >[Re:15] おおさんは書きました : >古典的なSDSPAGEなので、BISTRISをつかった > ものをつかってみようかなあ、、あれってSHの再酸化 > が通常のより起こりにくいんですよね。 > running bufferに亜硫酸ナトリウムを入れていれば、再酸化を防げるそうです。 あと、pHもニュートラルなので、流れている間、蛋白質のおかれている状況はかなり違うでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.818-15 - 2009/07/08 (水) 22:40:44 - おお >[Re:11] りょうさんは書きました : > 僕の体験談ですが･･･ > そのときは愕然としましたが･･･ ふつうにSDSPAGEして、全く期待した所にバンドがなく、 全部ゲルのトップに来たとなると、、、、確かになんじゃこりゃー なんて言いたくなりますね。 > > よって，そのタンパク質の処理は，尿素-ジチオスレイトールを用いたサンプルバッファーで５分間煮沸処理し，一晩４℃または室温で静置処理して，改善しました。 膜タンパクではウレアとの相性がいいようです。 へリックス構造を壊すのが得意なんでしょうか、、、 そういえば原因かもしれない場所はヘリックすには 関係なさそうです。 ウレアとDTTはそれなりにやったんですがいまいち ですね。古典的なSDSPAGEなので、BISTRISをつかった ものをつかってみようかなあ、、あれってSHの再酸化 が通常のより起こりにくいんですよね。

(無題) 削除/引用 No.818-14 - 2009/07/08 (水) 22:30:55 - おお >[Re:9] Cさんは書きました : > westernなどで特定の蛋白質がそのようになっているのでしょうか。（もしもそうならば蛋白質染色してみたときにパタンはどうでしょうか。きれいに流れていますか？蛋白質染色でも高分子量にアグリゲーションしている様子がみられますか。）それとも蛋白質染色してアグリゲートしているように見えているのでしょうか。 特定のタンパクです。えいどうについてはいつもきれいに 流れるように気を配っているつもりです。いつもトランスファー 後に染めて確認して、周りにきれいだろうと自慢していますので、、、 > > 蛋白質染色ではきれいに流れていて、ウェスタンでおかしいというならば、調べている蛋白質のもつ性質や修飾(例、Ubiquitinあるいはubiquitin-like蛋白質付加、ADP-ribosyl化、ジチロシン架橋などアミノ酸側鎖の酸化、切れにくい分子間S-Sの残存）などに起因する可能性が大きいとおもいます。 実は前に書きましたが、修飾は視野に入れています。 高濃度DTTでも効果がなさそうなので今のところS-S ではなさそうという感触です。 でもADP-ribosyl化はあたまになかったなぁ 酸化による架橋ですか、これも浮かばなかった。 そんなに酸化されるような環境とは思わなかったので。 ちょとそっちのほうも徐々に考えていこうと思いました。 最近polyEとか単一アミノ酸がたんぱく質に付加される という話もあるようですね。 > また蛋白質染色してアグっているように見えるならば、試料調製の方法(DNAの剪断が不十分でまだ粘性がある、カリウム塩やグアニジン、高濃度のトライトンなどSDSと合わない成分を含んでいる、SDS濃度と比べて蛋白質濃度がかなり高すぎる）や電気泳動（buffer組成などの間違い）など技術的な面に原因があるように思います。 カリウム塩やグアニジンは入っていません。グアニジンはアグリゲーションの 解離に使ってみたい試薬なのですがSDSと相性がわるいので、 ウレアを使ったりしましたがどうも解離しないようです。 トライトンは入っているのですが、上限はどのくらいの濃度とお考えでしょうか? 注目のタンパクはある状況(漠然とシカ書かないですがお許しください) でそのあグッているとおもわれるバンドが出て、抽出方法や 細胞の状態がほとんど変わらないその他の状態で同様に検出しても でてきませんので、テクニカルという面でのとらぶるはオミットして 考えてます。

(無題) 削除/引用 No.818-13 - 2009/07/08 (水) 22:10:22 - おお >[Re:8] a1さんは書きました : > 目的としてはアグった蛋白質を解離、もしくは除去したい、というより > むしろアグっている事を証明したいというむきでしょうか？ ありがとうございます。 どちらかといえば後者ですね。 > 後者でかつ細胞質蛋白ならばチューブリンの脱重合阻害剤を使ってとか。 ケミカルという観点でヒントになりました。 聞いてみるもんですね。 > > そもそもあぐるのはどこの時点でしょうか？ > 細胞内で既にあぐってる？それともエクストラクトにした段階で？ これは何とも言えませんね。難しいところというか、 痛いところです。 > > 後は使っているのが強制発現の系ならdeletion mutant（違うタグの付いた）を使うとか。 > これもある種のアプローチかもとひそかに思ってはいます、、、

(無題) 削除/引用 No.818-12 - 2009/07/08 (水) 21:50:27 - おお >[Re:7] ともさんは書きました : > アグル原因ってDNAではないのですか？？ > 強くソニケーションして、遠心30分くらいやれば解消しませんか？ DNAは疑ってなかったです。そもそも、ライセートはサンプルバッファー で得られるようなドロドロの状態ではありませんし、えいどうパターンも きれいですから。ソニケーションも思いつきませんでした。 使えるかもしれませんね。 ソニケーションはアグルからしないという人もいるようですが、 解消することもあるかもしれません。 Thank you so much!

(無題) 削除/引用 No.818-11 - 2009/07/08 (水) 18:57:15 - りょう 僕の体験談ですが･･･ 以前，膜タンパク質を扱っているときに，SDS-PAGEで流れないことが起こりました。 教授のアドバイスで全ゲルを染色してみたところ，SDS-PAGEの濃縮ゲルと泳動ゲルの境またはその近辺，または濃縮ゲルのウエル直下にバンドが見られたことから，アプライしたタンパク質はアグっていると判断しました。 そのときは愕然としましたが･･･ よって，そのタンパク質の処理は，尿素-ジチオスレイトールを用いたサンプルバッファーで５分間煮沸処理し，一晩４℃または室温で静置処理して，改善しました。 参考まで。

(無題) 削除/引用 No.818-10 - 2009/07/08 (水) 16:32:45 - A > L-arginineはどうでしょう？ > 大腸菌で発現させた目的蛋白質がinclusion bodyに含まれてしまうとき、L-arginineを加える方法があるとききました。実際に自分では、行ったことがないですが。思いつきでごめんなさい。 参考までにですが過去にArg以外でGlyやProが使われたことがあると論文で 読んだことがあります。 また私自身の経験で以前あるタンパク質でArgで全くうまく行かなかった のにGlyにかえたところ状況が劇的に変わってうまく行ったことがあります。 この辺りはやはり目的タンパク質の性質によるでしょうから試すしか ありませんが。Proは私自身も使ったことはありません。なにぶんArgや Glyにくらべ費用がかかるので。

(無題) 削除/引用 No.818-9 - 2009/07/08 (水) 12:25:45 - C westernなどで特定の蛋白質がそのようになっているのでしょうか。（もしもそうならば蛋白質染色してみたときにパタンはどうでしょうか。きれいに流れていますか？蛋白質染色でも高分子量にアグリゲーションしている様子がみられますか。）それとも蛋白質染色してアグリゲートしているように見えているのでしょうか。 蛋白質染色ではきれいに流れていて、ウェスタンでおかしいというならば、調べている蛋白質のもつ性質や修飾(例、Ubiquitinあるいはubiquitin-like蛋白質付加、ADP-ribosyl化、ジチロシン架橋などアミノ酸側鎖の酸化、切れにくい分子間S-Sの残存）などに起因する可能性が大きいとおもいます。また蛋白質染色してアグっているように見えるならば、試料調製の方法(DNAの剪断が不十分でまだ粘性がある、カリウム塩やグアニジン、高濃度のトライトンなどSDSと合わない成分を含んでいる、SDS濃度と比べて蛋白質濃度がかなり高すぎる）や電気泳動（buffer組成などの間違い）など技術的な面に原因があるように思います。 抽出、抽出bufferの組成やサンプル前処理、検出方法などの情報がわかれば原因は推察できるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.818-8 - 2009/07/08 (水) 11:23:28 - a1 目的としてはアグった蛋白質を解離、もしくは除去したい、というより むしろアグっている事を証明したいというむきでしょうか？ 前者でかつ除去したいなら他の方が仰っているように遠心（又は超遠心）でいけそうな気がしますが 解離に関しては既に色々お試しのようで思いつきません。 後者でかつ細胞質蛋白ならばチューブリンの脱重合阻害剤を使ってとか。 そもそもあぐるのはどこの時点でしょうか？ 細胞内で既にあぐってる？それともエクストラクトにした段階で？ 後は使っているのが強制発現の系ならdeletion mutant（違うタグの付いた）を使うとか。 すいません、質問の答えになってなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.818-7 - 2009/07/08 (水) 09:30:30 - とも アグル原因ってDNAではないのですか？？ 強くソニケーションして、遠心30分くらいやれば解消しませんか？

(無題) 削除/引用 No.818-6 - 2009/07/08 (水) 04:33:38 - おお みなさまありがとうございます。 >[Re:5] Cさんは書きました : > クルードな試料なのでしょうか。であればどのような由来の試料でしょうか。それとも精製した単品の蛋白質なのでしょうか。アグっていると判断した根拠はなんでしょうか。 クルードなサンプルです。マンマルの細胞や組織をライシスしたものです。 あグッているという根拠はまだ 乏しいと私も思っていますので、実はあグッている以外の 可能せいを模索しながら、あグッている場合の手のうちかた をこのとぴでお伺いしようかと思っていました、 あグッてないとすると、修飾かスプライシングアイソフォーム などでしょうか、、、今回は後者はあまり考えられないですが (cDNAの過剰発現でタグ抗体で検出できますから)。 >[Re:4] うさんは書きました : > むしろボイルするのではなく、60〜70℃くらいで５〜６０分熱処理というのがあった気がします。 > > 疎水性の高いタンパク質をやるときは、たまーに。 １度以前に疎水性のタンパクでそういうのを経験しています。 その時はボイルを避けてました。 今回もいろいろ温度を振りました。室温から94度で30分という 両方に極端な処理をしましたがいまいちです。

(無題) 削除/引用 No.818-5 - 2009/07/07 (火) 22:47:08 - C クルードな試料なのでしょうか。であればどのような由来の試料でしょうか。それとも精製した単品の蛋白質なのでしょうか。アグっていると判断した根拠はなんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.818-4 - 2009/07/07 (火) 15:13:19 - う むしろボイルするのではなく、60〜70℃くらいで５〜６０分熱処理というのがあった気がします。 疎水性の高いタンパク質をやるときは、たまーに。

(無題) 削除/引用 No.818-3 - 2009/07/07 (火) 06:26:11 - おお >[Re:2] あべちゃんさんは書きました : > L-arginineはどうでしょう？ > 大腸菌で発現させた目的蛋白質がinclusion bodyに含まれてしまうとき、L-arginineを加える方法があるとききました。実際に自分では、行ったことがないですが。思いつきでごめんなさい。 ありがとうございました。ご指摘で思い出しました。 確かにアミノ酸はタンパクの安定化に使われるようですね。 ある論文ではHISカラムでイミダゾールで溶出して、 イミダゾールを抜かないで安定化しているという文献がありました。 論文では同様の理由でヒスチジンもつかえるということと Argにも同じような効果があると書いてたと思います。 ただ今回のアグルは変性条件下でもあぐり、生理的な活性は さておきはがしたいと言うのと、タンパクが生理的条件下で すでにそういう状態である可能性があるという面があります。

(無題) 削除/引用 No.818-2 - 2009/07/07 (火) 02:52:27 - あべちゃん L-arginineはどうでしょう？ 大腸菌で発現させた目的蛋白質がinclusion bodyに含まれてしまうとき、L-arginineを加える方法があるとききました。実際に自分では、行ったことがないですが。思いつきでごめんなさい。

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